凝胶过滤的几道 “弯”

2023-02-06 10:02:48, Xu Yang Cytiva(思拓凡)




凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography)也称为体积排阻层析(Size Exclusion Chromatography),是根据分子大小和形状的差异进行分离的一种简单可靠的层析技术。凝胶过滤层析属于非吸附类层析。


凝胶过滤填料为三维立体网状结构,由于凝胶网孔大小的限制,大分子将不能进入凝胶颗粒内部(即被凝胶排阻在外),仅能在凝胶颗粒间隙移动,并随缓冲液一起从柱底先行洗脱。小分子可以自由进入并扩散到凝胶颗粒内部,小分子历经的路径更长,将较晚从柱上洗脱。因此样品混合物按分子由大到小的顺序先后洗脱出来。典型的SEC结果如图1 所示:


图1:SEC分离结果


1959年第一代的葡聚糖凝胶Sephadex问世,开启了凝胶过滤纯化的大门。随着技术和原料的革新,相继推出了Sepharose琼脂糖系列填料及高度交联的Super-系列填料。不同凝胶过滤填料的特征如下图2所示:


图2:凝胶过滤填料类别及特征


Sephadex

Sephadex是早期发现的一类填料,由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成三维网状凝胶颗粒。按照交联度的不同,用Sephadex G加一个数字来区别,数字越小交联度越大,形成的孔径越小,对应的分离范围越小。Sephadex G系列填料,目前一般主要用于脱盐与缓冲液置换。

Sephadex G-25 (17003301) 加入羟丙基基团,反应形成LH 型烷基化葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 (17009001),适用于以有机溶剂为流动相,可以分离脂溶性物质或者天然产物,例如胆固醇和中药等。


Sepharose

Sepharose填料的分离范围上限非常大,是传统方法下大分子(例如病毒颗粒、DNA质粒等)快速分离的首选填料。Sepharose为非交联结构,不能高压灭菌,按琼脂糖含量为2%、4%、6%分成2B、4B及6B三种型号,三类产品具有不同的分离范围和压力特征。

当琼脂糖微球与2,3-二溴丙醇共价交联可得交联琼脂糖Sepharose CL(Cross-Linked),其热稳定性及物理化学稳定性大大提高,对应 CL-2B (17014001)CL-4B (17015001)CL-6B (17016001) 三种型号

Sepharose FF为90μm粒径的高度交联的琼脂糖填料,FF即为Fast Flow,具有更快的流速,大大加强了机械性能,填料经过去电荷处理,非特异性吸附极低,有效地提高了回收率。

Sepharose HP即High Performance, 34μm粒径,具有更高的分辨率,Sepharose系列基架已经广泛应用于各类层析填料中。


Sephacryl

Sephacryl 是葡聚糖与N,N’-亚甲基二乙酰胺交联而成,是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl 的优点就是它的分离范围很大,排阻极限甚至可以达到108它不仅可以用于分离一般蛋白,也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。 Sephacryl化学和机械稳定性好,分辨率也较高。


Superose

Superose由高交联琼脂糖组成。宽广的分离范围配合高分辨率,能一次性分离生物分子大小差异大的混合物。填料刚性好,在高粘性液体如8M尿素下也能保持流速,适合糖类、核酸、病毒,特别是包涵体蛋白在促溶剂中的纯化。其中 Superose 6 (29091598) 的球蛋白分离范围是5 KD—5,000 KD,因此其广泛应用于大分子的分离纯化。


图3:用于精细分离的凝胶过滤产品的分离范围


Superdex

Superdex由葡聚糖和琼脂糖的复合基质高度交联组成。结合了葡聚糖的出色的分离特性与交联琼脂糖的物理和化学稳定性,因此Superdex展现出更高的选择性和分辨率。其中Superdex 的数字部分30、75、200是指其具有不同的分离范围。


图4.Superdex结构示意图


Superdex系列是目前分辨率、选择性最高的凝胶过滤填料,并且还具有化学稳定性高、非特异性吸附低等优点,广受用户的欢迎。Superdex Increase系列预装柱则是进一步减小了填料粒径,提高了填料的耐压性能,提升了分辨率的同时有效缩短了分离纯化所需的时间。



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