聊一聊荧光定量PCR实验数据的导出

2023-02-06 10:37:21, FAS 颜庆瑜赛默飞世尔科技生命科学产品

使用赛默飞的荧光定量PCR仪的老师，在软件上分析完得到实验结果以后，很多情形下是需要把实验结果保存成为一个数据文档的，例如导出CT值作更多的数据处理。最常用的是导出excel表格，这是可以在每个仪器型号对应的分析软件上进行导出的，操作也是十分简便。

这里以7500的2.0以上的软件为例介绍如何导出：

一、导出实验的数据表格

打开要导出数据的实验结果，点击软件左上角File下拉弹出选项，点击下拉工具栏Export按钮，弹出导出对话框，如下图一。在这里，您可以完成导出的设置。

图一

这个对话框左侧的Export Properties的选项卡中：

Select data to export 的意思是，在进行导出的时候，可以选择导出的数据很多，根据需要选择需要导出的数据项。

这包括：

Sample setup：是指这次实验编板的信息，例如孔号、样品名称、样品颜色等等。

Results：是指这次实验的结果，里面包含了CT值，RQ值，Quantity值等信息。大部分老师只需要选择此项即可。

Raw data：是每一循环，每张滤光片所采集到的原始荧光值。

Multicomponent Data：是每个孔、每一循环、每一种荧光染料的数据。

Amplification Data：是指每个循环，每个孔做了参比荧光校准后、以及基线扣除后分别得到的荧光值。即每个循环的Rn与ΔRn的数值。

后面3个导出项适合需要自行作图的老师。

Select one file or separate files的意思是，选择所有数据项导出时合并成为一个文件还是分开的文件。

选择One File时：

如果选择导出的是*.xls格式导出，会生成一个包括了多个数据项表格的excel文件。
如果选择导出的是*.txt格式导出，则导出的文本文件里面，根据导出数据项进行分组显示。

选择Separate Files时，每个导出的数据项分开到相应的一个文件中。

Enter export files properties的意思是，输入导出文件性质。

Export File Name：输入导出文件的名字。选择单个文件导出时，默认是实验数据的名字后面后缀_data。导出多个文件时，后缀为对应的数据类型（__results， _RawData）等等。

File Type：选择导出的格式，有txt 和xls两个选项。建议有安装Office软件的老师，选择*.xls，为excel格式文档，方便后面的数据统计。

Export File Location：查看默认导出路径，或者右侧点击Browse，找到合适的输出路径。

（图二）

图二

如果在Open File(s) when export is complete前面打上勾，只要点击右下角的Start Export按钮，电脑就会在导出后自动打开这个文件。

个性化导出：

如果觉得每个导出数据项的内容太多了，只需要某个结果项，例如只需要CT值，那么，这时您可以作一个个性化导出设置，

点击右边选项卡Customize Export，如下图，在Customize的下拉项中选择要个性化导出项目，然后在下面的需要的选项前面打√，然后再导出。如下图三

图三

除了这样导出数据外，其实7500 2.0以上的软件还能做其他的导出，包括：

二、导出每个实验图，以jpeg格式保存：

在每幅结果图谱上面(如图四)，都有一个小图标，鼠标指向的时候，会显示Save as jpeg image，点击这个图标，会弹出对话框，输入名字和保存路径，就能以jpeg的格式保存这个结果图。

图四

三．生成详细的实验报告，可以直接打印或者生成PDF文件：

打开某个实验结果，点击左上角的File（图五左）, 弹出下拉选项，选择Print Report...，会弹出打印选项对话框。如下图五右。扩增图谱建议选择第一个Amplification Plot (ΔRn vs.Cycle)。

图五

点击下方的Print Report按钮，会弹出一个打印保存对话框（图六）。在打印机名称的下拉选项可以选择一个连接电脑的打印机。如果没有安装打印机，下拉有选项Microsoft Print To PDF，再点击确定，设置文件名称与保存路径，这时可以打印成为一个PDF文件。这次实验结果就会以一个实验报告的结果导出了。

图六

四．生成PPT文件，方便做汇报：

同样也是在软件主界面的左上角点击file下拉选项，选择Create Slide...（图七左）。在弹出的对话框选中要生成PPT结果的内容，然后点击Create Slides，有安装Office软件的电脑这里会立刻生成一个带有结果的PPT文件并自动打开。

图七

其它仪器型号的分析软件的导出的功能都是相同的，只是界面有差异，这边就不再详细举例了。

最后，举一个导出异常的例子：

某天收到一位用户发来的求助：“技术工程师，我在7500上的相对定量实验结果明明有扩增，有CT值，为什么在进行导出时，result选项是灰色的，不能导出呢？”

拿到这位老师的eds文件后，我们首先看了这个实验结果（如下图八）：

图八

可以看到结果是正常的扩增，每个孔也有相应的CT值。但是在导出的界面，result选项前面是灰色的，如下图九：

图九

这时我们可以回来认真查看扩增图谱，可见扩增图上面有很多杂乱的线。

接着我们查看了这个结果的多组分图multicomponent plot（如下图十）:

图十

可以看到，这个扩增反应是属于正常的染料法扩增加熔解曲线的荧光结果。有ROX参比荧光的，荧光比较高，推测这位老师添加的是高浓度ROX参比荧光的预混液。但是这个不是导致不能导出的原因。

这时我们再仔细观察，发现有些孔，SYBR和ROX荧光是0。可以猜测，应该是有些孔是没有添加预混液，是空的孔，但是老师在设置反应信息的时候，把这些孔的信息也设置进去了。

接着，我们可以通过查看质量概览的QC Summary结果项，看看有哪些孔出现了这样的的异常：如下图十一：

图十一

出现了报错的孔，就是右边框起来的孔，分别出现了以下一些提示：包括Bad passive reference signal（参比荧光信号差）、High standard deviation in replicate group（重复孔SD值高）、Noise spikes （噪音峰）、No signal in well （孔没有信号）、Zero Passive Reference（参比荧光为0）、Exponential algorithm failed （指数增长期算法失败）、Baseline algorithm failed （基线期算法失败）和Cт algorithm failed （CT值算法失败）。

一眼看过去好像是有很多的问题，其实根据图十一下的多组分图，结合老师设置的样品信息得知，这些孔都是阴性对照，但是老师没有在这些孔里面添加预混液，是一个空的孔，这是不符合我们常规的阴性对照的要求。

我们做荧光定量PCR实验，阴性孔一般指的是无模板对照，就是这个孔除了模板DNA不加，换成是无核酸酶水或者稀释液，其它的成分都一样的孔。

在跟老师沟通以后，证实了我们的猜想。那么这时，这个结果还能导出吗？答案是可以的。

这些空的孔，由于是没有预混液的本底荧光，但是我们又设置了强行去采集荧光，就会导致得到的Rn值杂乱，信号很高，大部分在正常曲线上方，这就是在扩增图上那些杂乱的线。同时，这也会影响结果的分析和导出。我们需要把这些孔的信息去掉。

只需要在前面样品设置那里，把这些阴性的孔的信息给清理掉，然后在结果那里重新分析，这些杂乱的线就没有了。结果也能正常导出了，如图十二（不过这个结果这时就没有了阴性对照的结果作为参考了）。

由此可以得出结论，建议老师在实验中，尤其是相对定量的实验，如果某些孔是没有添加任何液体的，不要把这些孔的信息设置上，避免出现以上的异常结果。