2023-01-31 17:41:01, 乐研 上海皓鸿生物医药科技有限公司
蛋白−蛋白偶联物在生物技术和生物制药研究领域的发展中发挥着重要的作用,比如治疗性双特异性抗体、生物成像剂和双功能酶[1−4]。这些偶联物通常来源于基因融合的重组表达蛋白[5,6]。虽然融合蛋白比较常用,但仍具有一定的局限性,包括结构域的不正确折叠,稳定性差,仅能N-C融合等等[5,6]。然而,翻译后蛋白质-蛋白质偶联策略能够拓展多样性,例如N-N,C-C偶联等[7],比较常用的方法是通过带有功能性反应基团的连接子与蛋白反应。
马来酰亚胺与半胱氨酸巯基的反应极为常用,但可能发生逆迈克尔加成以及与内源硫醇发生硫醇交换反应[8,9,10,11](图1)。此文献中,Michele组描述了一种同源双功能连接策略,基于半胱氨酸与全氟芳香族试剂的芳基化,通过亲核取代产生稳定的S−C(sp2)键。“π-钳”序列(Phe-Cys-Pro-Phe)[12,13]增强了半胱氨酸与全氟芳香族化合物的反应,已被应用于ADCs和PROTAC开发[12,14,15]。Michele组通过“π-钳”序列和位点特异性偶联,使用双五氟苯磺酰胺官能化的连接子(L1/L2)制备得到了更加稳定连接的蛋白质-蛋白质偶联物(图1)。
图1:左为二聚体合成流程;右为马来酰胺和五氟苯磺酰胺连接子比较
事实上,这种连接策略针对SARS-CoV-2刺突蛋白蛋白受体结合域(RBD)上两个不同表位计算设计的抗体((desAbs)二聚体,命名为C1及C2(图2),并将其偶联制备为同/异二聚体,有利于增加其大小,提高结合亲和力。因此作者以此为模型进行实验。
图2:抗体C1,C2
首先,作者将C1进行工程化,在序列中引入半胱氨酸。C1-DCE中含有D-C-E,C1-π中含有“π-钳”序列(F-C-P-F)。实验发现,C1-DCE的反应性不足以转化为完全修饰的单体,但C1-π反应性明显更高,在温和条件下3小时内完全转化为C1-L1(图3)。除此之外,制备的C1-π突变体C1-A-C-P-A对照的实验结果也表明,“π-钳”序列是增加反应性的来源,对于二聚化制备必不可少。
因此作者在连接子L1与C1-π孵育24小时后,制备得到了同二聚体C1C1-L1。类似的,也通过连接子L2及C2-π制备了不同的同二聚体。异二聚体的制备则是通过将纯化后的C1-L1与C2-π孵育。纯化后的偶联物经过SDS-PAGE的表征及二级结构,热变性温度的测试,表明其结构未受到影响,且具有稳定性。
图3. 同二聚体/异二聚体制备及生物物理性质表征
接下来,作者探究了异二聚体制备的第二步反应是否对π序列的半胱氨酸具有选择性。由此,作者设计了C1-π-DCE,在Tev酶切割序列的上游与下游分别含有D-C-E序列与“π-钳”序列(F-C-P-F),即两个不同的半胱氨酸(图4)。作者制备了C1-π/C1-π-DCE-L2异二聚体,并使用Alexa-647荧光染料与仍暴露的半胱氨酸反应,随后使用Tev酶切。实验结果如图4bc。Tev酶切割后二聚体未解偶联,并且荧光分子并未与C1-π-DCE一同被切下,说明反应按照图4a所示发生,偶联步骤对π序列的半胱氨酸具有特异型。
图4.C1-π/C1-π-DCE-L2异二聚体制备及表征
最后,作者评估了二聚体对抗体KD的影响。微尺度热泳测量的结果表明,二聚体相对于组成的单体KD值提高10-60倍。这是由于“强制邻近效应”导致偶联物解离变慢。不同的二聚体均具有相似的KD值,说明他们与RBD的结合模式相似。
总而言之,五氟苯磺酰胺连接子与基于“π-钳”序列的半胱氨酸制备得到了化学位点特异性的蛋白的同二聚体及异二聚体,这种方法有望应用于制备更多的双特异性ADCs,也有可能成为有效的治疗药物。
1047270 | 1176528 | 1178643 |
1178594 | 1175664 | 1179823 |
1171262 | 1187056 | 1187129 |
参考文献
下滑查看更多 ↓
(1) Yu,K;Liu,C;Kim,B.-G.;Lee,D.-Y.Synthetic fusion protein design and applications.Biotechnol.Adv.2015,33,155−164.
(2)Ma,J.;Mo,Y.;Tang,M.;Shen,J.;Qi,Y.;Zhao,W.;Huang,Y.;Xu,Y.;Qian,C.BispecificAntibodies:FromResearchtoClinical Application.Front.Immunol.2021,12,626616.
(3)Yuste,R.Fluorescencemicroscopytoday.Nat.Methods2005,2,902−904.
(4)Iturrate,L.;Sánchez-Moreno,I.;Oroz-Guinea,I.;Pérez-Gil,J.;García-Junceda,E.PreparationandCharacterizationofaBifunctionalAldolase/KinaseEnzyme:AMoreEfficientBiocatalystforC-CBond Formation.Chem.-Eur.J.2010,16,4018−4030.
(5)Zhang,J.;Yun,J.;Shang,Z.;Zhang,X.;Pan,B.Designandoptimizationofalinkerforfusionproteinconstruction.Prog.Nat.Sci.2009,19,1197−1200.
(6)Bell,M.R.;Engleka,M.J.;Malik,A.;Strickler,J.E.Tofuseornottofuse:Whatisyourpurpose ProteinSci.2013,22,1466−1477.
(7)Baalmann,M.;Neises,L.;Bitsch,S.;Schneider,H.;Deweid,L.;Werther,P.;Ilkenhans,N.;Wolfring,M.;Ziegler,M.J.;Wilhelm,J.;Kolmar,H.;Wombacher,R.ABioorthogonalClickChemistryToolboxforTargetedSynthesisofBranchedandWellDefinedProtein−ProteinConjugates.Angew.Chem.,Int.Ed.2020,59,12885−12893
(8)Glennie,M.J.;McBride,H.M.;Worth,A.T.;Stevenson,G.T.PreparationandperformanceofbispecificF(ab′gamma)2antibodycontainingthioether-linkedFab′gammafragments.J.Immunol.1987,139,2367−2375.
(9)Hvasanov,D.;Nam,E.V.;Peterson,J.R.;Pornsaksit,D.;Wiedenmann,J.;Marquis,C.P.;Thordarson,P.One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic HeteroproteinDimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions.J.Org.Chem.2014,79,9594−9602.
(10) Scheer, J. M.; Sandoval, W.; Elliott, J. M.; Shao, L.; Luis, E.; Lewin-Koh, S.-C.; Schaefer, G.; Vandlen, R. Reorienting the Fab Domains of Trastuzumab Results in Potent HER2 Activators. PLoS One 2012, 7, No. e51817.
(11) Kane, B. J.; Fettis, M. M.; Farhadi, S. A.; Liu, R.; Hudalla, G. A. Site-Specific Cross-Linking of Galectin-1 Homodimers via Poly- (ethylene glycol) Bismaleimide. Cell. Mol. Bioeng. 2021, 14, 523−534.
(12) Zhang, C.; Welborn, M.; Zhu, T.; Yang, N. J.; Santos, M. S.; Van Voorhis, T.; Pentelute, B. L. π-Clamp-mediated cysteine conjugation. Nat. Chem. 2016, 8, 120−128.
(13) Dai, P.; Williams, J. K.; Zhang, C.; Welborn, M.; Shepherd, J. J.; Zhu, T.; Van Voorhis, T.; Hong, M.; Pentelute, B. L. A structural and mechanistic study of π-clamp-mediated cysteine perfluoroarylation. Sci. Rep. 2017, 7, 7954.
(14) Lee, M. D.; Tong, W. Y.; Nebl, T.; Pearce, L. A.; Pham, T. M.; Golbaz-Hagh, A.; Puttick, S.; Rose, S.; Adams, T. E.; Williams, C. C. Dual Site-Specific Labeling of an Antibody Fragment through Sortase A and π-Clamp Conjugation. Bioconjugate Chem. 2019, 30, 2539− 2543.
(15) Gama-Brambila, R. A.; Chen, J.; Dabiri, Y.; Tascher, G.; Ne mec, ̌ V.; Münch, C.; Song, G.; Knapp, S.; Cheng, X. A Chemical Toolbox for Labeling and Degrading Engineered Cas Proteins. JACS Au 2021, 1, 777−785
03-19
上海市委常委、浦东新区区委书记、中国(上海)自由贸易试验区管委会主任朱芝松率队到安捷伦走访调研03-19
明天见 | 布鲁克光谱邀您参加SEMICON CHINA 202403-19
开学季福利|与哈希一同了解实验室仪器操作干货,还有好礼相赠~03-19
【新视界】哈希水质检测行业应用精讲—深入浅出,解锁应用点03-19
揭牌仪式丨凯米拉化学研究(上海)与SCIEX中国共建化工行业前沿实验室03-19 SCIEX
#SCIEX OS知多少# 您的SCIEX OS小故事03-19 sciex客户服务
轻松应对更新迭代迅速的合成大麻素检测 ——SCIEX 高分辨质谱一针进行近300种合成大麻类毒品筛查03-19 SCIEX
SCIEX学堂新课 | 质谱及数据的底层逻辑第3期—质量数与同位素03-19 SCIEX
丹家智选商城闪亮上线,开启全新整合式多品牌原厂直销云购物新体验03-19 SCIEX
焕新升级 提效赋能 | SCIEX高端色谱质谱产品助力大规模设备更新!03-19 SCIEX
SCIEX 2024 CACLP 焕新出发03-19 SCIEX
设备更新指南丨布鲁克X射线荧光光谱仪系列03-19
设备更新指南丨布鲁克电子显微分析仪器系列03-19
响应设备更新政策 | 2024 牛津仪器物理科学产品选型指南03-19
Oi Service直播讲堂:牛津仪器能谱仪及窗口的日常维护03-19 牛津仪器客户服务
响应设备更新政策 | 2024 台式核磁共振产品选型指南03-19 牛津仪器
提效增能 · 创新提质丨赛默飞助力仪器升级加速生成新质生产力03-19 助力仪器升级的
一键下载|赛默飞助您解锂电技术难题03-19
响应设备更新政策 | 2024 低温强磁场设备选型指南03-18