应用案例 - 使用CTS Xenon电转系统和CTS TrueCut Cas9蛋白实现高效基因编辑

伴随细胞治疗产业的商业化和更多创新疗法的获批临床，业内对“采用自动化、封闭式设备替代人工操作，以减少潜在的污染风险，提高工艺开发速度和效率”逐渐达成共识。除设备外，细胞治疗药物开发商实施的风险管控策略，还需要确保生产制造工艺中包含适用于临床制造的设备和试剂。

本案例将展示Gibco™ CTS™ Xenon™大规模电转染系统如何与Gibco™CTS™ TrueCut™ Cas9蛋白一起使用，从而为临床细胞治疗制造提供了简化的途径。

材料和方法

图1：自体T细胞治疗工作流程。

1. PBMC分离冻存: 使用Rotea逆流离心系统将PBMC从单采血中分离出来，冻存备用。

2. T细胞活化：在第0天进行细胞解冻，使用Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28磁珠活化PBMC中的T细胞。

3. T细胞扩增：在添加了Gibco™ CTS™免疫细胞血清替代物（ICSR）和其他成分的Gibco™ CTS™ OpTmizer™ T细胞扩增无血清培养基中扩增T细胞。

4. 电转染：第3天，使用Invitrogen™ Neon™转染系统或CTS Xenon电转染系统，结合CTS TrueCut Cas9蛋白和Invitrogen™ TrueGuide™合成gRNA（sgRNA）对活化的T细胞进行电转染。在每个电转染条件下将T细胞分成两个细胞群进行下游分析，然后放回完全CTS OpTmizer培养基中进行扩增。实验方案参见图2。

图2.实验和样本。（A）实验条件和电转染参数。（B）样本信息。

5. 分析鉴定：第6天和第10天，使用Invitrogen™ Attune™ NxT流式细胞仪分析细胞的扩增、活性和表型以及敲入和敲除效率。

6. CAR T杀伤试验：第9天冻存细胞后再解冻，以模拟临床实践。第12天将效应CAR T细胞或对照细胞（未修饰的细胞毒性T淋巴细胞(CTL) ）解冻并接种到含有GFP标记的Nalm6靶细胞的96孔板中，效应与靶细胞（E:T）的比率范围为10:1至0:1。将E:T细胞混合物孵育6小时，并使用EVOS M5000成像系统和流式细胞仪分析细胞毒性百分比 （图3）。

图3.细胞毒性试验工作流程。

实验结果

1

活性和细胞扩增

电转染成功是转染效率和细胞活性之间的平衡，一般认为电转染后活性大于70%是可以接受的。在电转染后72小时评估细胞活性，活性在不同电转染体积规模上保持一致，包括无电转染对照组。这种一致性表明，电转染本身以及电转染体积并没有显著改变细胞活性（图4）。此外，通过CTS Xenon系统进行电转染后，所有供体的细胞活性均远高于70%。

在电转染操作前（即第3天）记录细胞数量，并在电转染后第3天和第7天（分别为第6天和第10天）评估细胞生长，以确保修饰的细胞能够扩增。仅电转染的对照细胞（EP only，即不含有效载荷)和接受有效载荷的修饰细胞（Xenon）能够在7天内扩增25至35倍（图5）。如预期，由于有效载荷的内化和电转染的物理效应，修饰细胞表现出略低的扩增。对于所有供体和电转染条件，第10天的细胞活性约为90%。

图4. 用CTS Xenon系统在电转染后第6天（转染后第3天）测量的细胞活性。

图5. 在电转染当天（第3天）以及电转染后第3天和第7天（分别为第6天和第10天）测试细胞扩增和活性。

2

转染效率

图6展示了一致的基因编辑效率；与Neon系统（敲入效率为15-23%）相比，CTS Xenon系统的效率更高（敲入效率为22-44%），这表明CTS Xenon系统可轻松用于扩展和优化封闭系统中的转染过程。

图6.基因编辑效率。浅蓝色条表示无电转染对照组的总细胞数，深蓝色条表示两个电转染体积（100 μL和1 mL）组的总编辑细胞数。电转染后3天（第6天）采集数据。

3

T细胞表型

在Attune NxT流式细胞仪上评估T细胞表型。与无电转染对照相比，在测试的电转染体积中，表型变化最小或没有表型变化。在比较活化、电转染和扩增前后的细胞时，表型发生了变化，但单独的电转染没有显著影响（图7）。

图7.电转染后的表型数据。深蓝色条代表CD4+细胞，浅蓝色条代表CD8+细胞，灰色条代表双阳性或双阴性CD4/CD8细胞。

4

细胞毒性

使用CAR T细胞杀伤试验评估细胞毒性。解冻后，CAR T细胞表现出CAR构建体的持续表达，并证明能够有效杀死GFP标记的靶细胞（图8）。

图8.在电转染后第12天测试CAR T细胞的细胞毒性功能。评估效应细胞的编辑效率或性能（A），并以不同的E:T比率将效应细胞与GFP标记的靶细胞一起孵育（B，C）。细胞有效杀死靶细胞，表现出所需的功能。

5

使用Xenon MultiShot电转染套件

（5-25 mL）进行扩展

为展示CTS Xenon系统的扩展能力，使用图2中引用的参数，在Xenon MultiShot电转染套件（5-25 mL）上供体C的细胞进行18 mL电转染实验。活性、电转染效率和表型分数在所有三个规模上均相似（图9）。一般而言，当移动到更大规模时，电转染总时间和细胞损失将是一个挑战，建议尽量减少细胞暴露于电转染缓冲液的时间。然而，从细胞暴露于电转染缓冲液到完成电转染方案，整个18 mL电转染所需的时间跨度不到25分钟，并且回收率在预期范围内。

图9.在CTS Xenon系统上扩展电转染体积。评估所得细胞的活性（A）、电转染效率（B）、表型（C）和编辑细胞总数（D）。电转染后3天（第6天）采集数据。

结论

随着监管机构实施更严格的要求以使这些疗法标准化，细胞治疗制造指南也在不断发展。确保用于细胞治疗制造的仪器和试剂具有适用性是我们Gibco CTS 产品设计的核心基础。

正如电转染效率和由此产生的CAR T细胞的功能性所证明的那样，CTS Xenon系统的设计旨在扩展并满足商业制造过程的要求。该系统可以与CTS TrueCut Cas9蛋白等试剂以及一系列专为细胞治疗制造而设计的产品和工具集成，以优化制造过程中的细胞工程步骤。

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