轻松选二抗除背景，都是小case！

新学期伊始，实验室又开始忙碌的打（zuo）“怪兽（shiyan）”中……

“wb结果一塌糊涂，非特异性条带实在太多”

“IHC的背景太强了，肿么办”

小编当年也深受其害，非特异性结合或背景干扰会严重影响我们的实验结果，不仅浪费试剂而且减缓实验进程。在WB，免疫荧光，免疫组化等各种免疫实验中，二抗被设计靶向免疫球蛋白（一抗），并用作免疫分析的检测试剂。需要强调的是，由二抗选择不当带来的“背景“不容小觑。那么，我们来细谈如何选对二抗，深扒那些 “剪不断理还乱”的“背景”，让 “背景“从此是路人。

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种属来源

首先是种属来源，我们需要注意的是二抗的种属来源必须不同于一抗的种属来源，例如，当使用的一抗是鼠源，那么二抗只能是非鼠源的。

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特异性反应

接着，要确保二抗可以识别目标一抗，除了要考虑一抗的物种，还包括一抗的类型和亚型。

如果一抗是兔源抗体，那么需要使用抗兔的二抗。一般来说，大多数一抗是在小鼠或兔的体内制备的，因此常用的二抗是抗鼠IgG和抗兔IgG。

另外，我们要选择靶向一抗类型或亚型的二抗。譬如，当一抗是IgG1,那么二抗可以选择抗IgG1或IgG。但是当选择IgG当做二抗，需要考虑或避免IgG2/3/4带来的“背景”。

3

交叉吸附

除了确保二抗识别一抗外，还有妙招提高二抗的特异性。交叉吸附指纯化后的二抗再次通过一个纯化柱，而该纯化柱上固定了其他种属来源的抗体或血清。因此，通过这种方法去除交叉反应性的蛋白，从而减少背景和提升抗体效价。

特别是多重标记实验中，对富含免疫球蛋白的组织或细胞中染色时，建议使用交叉吸附过的二抗。高度交叉吸附纯化的抗体降低了物种间交叉反应性和背景信号，可以很好的实现多重检测。Invitrogen提供丰富的多种属交叉吸附处理过的二抗。下图的二抗（货号A11034）经过与牛、山羊、兔、大鼠和人IgG以及人血清的交叉吸附处理。

图1. Visfatin ABfinity™重组兔单克隆抗体对Hela细胞染色的免疫细胞化学分析。(A) 使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗（货号A11034，绿色）检测一抗； (B) 使用DAPI进行核染色（蓝色）。使用Alexa Fluor 594标记的鬼笔环肽对actin蛋白进行染色（红色）。(C) visfatin蛋白的细胞质和细胞核定位的组合图。

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抗体片段

针对IHC和IF检测某些Fc受体表达丰富的组织比如脾脏，淋巴结等，降低非特异性还有奇招。F(ab’)2抗体片段不与Fc结合，从而大大减少背景的干扰。另外，F(ab’)2的分子量较小并且易于穿透组织，所以是IHC和IF的首选二抗。需要强调的是， 分子较小也意味着可以同F(ab’)2片段偶联的染料和酶也更少，从而使得这类二抗的灵敏度不及完整抗体形式的二抗。

图2.抗体的结构和名称

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标记物

此外标记物的选择至关重要，取决于所进行的应用以及如何检测二抗。标记物选择不当例如荧光染料也会造成“背景”。需要注意选择发射光谱不重叠的基团，避免信号干扰；再比如选择光稳定和亮度高的染料，如Alexa Fluor，Alexa Fluor Plus染料，卓越的亮度和较高的信噪比使其即使是较低丰度靶标也能很好实现检测。

图3. 与传统 800 近红外结合物相比，Alexa Fluor Plus 800 二抗（货号 A32735）在较低稀释度下可显示更多条带，灵敏度更高和检测范围更广。

最后值得注意，在IHC和IF中用生物素/链霉亲和素体系检测富含生物素样本也会导致强“背景”。

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