2022-12-22 18:13:40, 沃特世 沃特世科技(上海)有限公司
维生素是维持人体生命活动所必需的一类营养物质,大多数由食物供给,属于人体内的一类调节物质。维生素分为水溶维生素和脂溶维生素,脂溶性维生素是不溶于水而溶于脂类的一类维生素,在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要作用,包含维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。
VD在肝脏可转化为25羟基维生素D(25OH-VD),其浓度水平与体内的VD直接相关,因此体内25OH-VD2、25OH-VD3可作为检测VD水平的生物标志物。VK是激活凝血因子以及蛋白质C和S的必须辅助因子,目前已知主要有K1、K2、K3、K4几种形式,四烯甲萘醌VK2(MK4)既是VK2的家族成员,也是肝外组织中K1的代谢物。当这些脂溶性维生素缺乏或过量时均会对人体造成伤害。具体见下表:
一次性评估体内多种维生素水平,才能全面“查漏补缺”。准确测定人体中性维生素的含量,可以帮助临床医生准确评估人体维生素营养状态、吸收障碍或毒性水平。
解决方案
沃特世团队依托质谱平台ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD和 TQ-XS IVD开发了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术在维生素检测中的应用,在5 min内即可完成6种脂溶性维生素的同时分析。前处理采用Andrew Alliance机器人搭配Oasis μElution PRiME HLB的固相萃取板,实现样本前处理自动化,并解决LC-MS/MS检测维生素的各种挑战和难点。该方法检出限低、分离效果好、稳定性佳,可满足临床高通量自动化检测需求。
图1. Andrew+移液机器人用于6种脂溶性维生素前处理操作时的工作台布局,以及ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-XS IVD检测平台。
实验部分
前处理
样本预处理:取100 μL 血清或者BSA稀释标准品,加入内标工作液,涡旋混匀,随后加入乙腈沉淀蛋白,离心取上清液,做SPE净化。
液相色谱条件
液相色谱系统:ACQUITY UPLC I-Class系统
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱, 1.7 μm,2.1 mm x 50 mm
进样体积:5 μL
结果与讨论
高通量,一针进样,同时检测
该方案5 min内即可完成6种脂溶性维生素的同时测定,可同时检测血清中维生素A(VA)、25-羟基维生素D2(25OHVD2)、25-羟基维生素D3(25OHVD3)、维生素E(VE)、维生素K1(VK1)、四烯甲萘醌K2(VK2-MK-4),真正实现“一针进样,同时检测”。
图2. 6种脂溶性维生素的标准品和血清色谱图。
灵敏度高,线性范围宽,满足临床检测需求
正常人体血清中维生素A含量113 - 977 ng/mL;维生素E含量3.8 - 17 μg/mL;维生素D含量20 - 50 ng/mL;维生素K1含量为0.10 - 2.20 ng/mL。由于6种脂溶性维生素在血清中含量差异较大,VK1、MK4和25OH-VD2含量低,同时测定高低浓度物质是串联质谱测定的难点,常存在低浓度、灵敏度差及高浓度过饱和现象。而Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD优异的灵敏度及超宽线性范围,可实现同时准确定量这几种维生素。
自动化前处理,满足高通量检测需求
Andrew+机器人可在无人值守状态下自动完成移液、震荡、混匀和96孔板SPE前处理过程。不仅大幅节省了样品处理的时间,提高了通量,还可以简化样品制备过程、减少实验失误,从而确保分析结果的稳定重现。手动前处理96个样本的时间大概是2 - 3 h。如果用Andrew+做自动化前处理,只需要提前把溶剂和样本放到设置好的Domino blocks里中就可以完成自动化前处理和SPE流程。过程仅需不到1 h就可以完成。
结论
本方案使用Waters UPLC I-Class超高效液相色谱系统搭载UPLC色谱柱进行分离,再用Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD串联四极杆质谱仪对血清样品中6种脂溶性维生素定量检测。96个样本的前处理不到1 h,每个样本的液相分析时间仅5 min,每天可以检测至少200例样本。6个脂溶性维生素的加标回收率85% - 115%之间,精密度RSD<8%,保证该方法检测样品的准确性和可靠性,可适用于临床高通量、自动化的样品检测。
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