使用SEC-MALS监测多糖的结构变化

2022-12-19 09:16:26 东曹（上海）生物科技有限公司

多糖作为最丰富的天然生物聚合物，其独特的理化特性、出色的生物相容性使其成为众多行业的首选材料。同时，由于其应用范围广、结构复杂，因此需对其进行彻底检查，并充分了解其分子特性。例如，若要研究其扩散特性，需将分子大小纳为一个重要参数。另外，葡聚糖的大小是目前影响红细胞聚集的首要因素，其中小分子会抑制聚集，大分子会促进聚集。而且，构象和分支行为过多使某些多糖在某些应用中要么十分适合，要么问题严重。

本应用是以普鲁兰和葡聚糖为例，将东曹HLC-8420GPC系统与LenS3多角度光散射检测器联用，介绍如何使用SEC-MALS方法来测定多糖的结构变化。

实验条件

仪器：HLC-8420GPC系统

色谱柱：TSKgel GMPWXL (13 μm, 7.8 mmID × 30 cm)×2

流动相：水+0.01 mol/L NaNO3和0.02 % NaN3

流速：0.7 mL/min

检测器：示差折光 (RI) 、LenS3 MALS检测器

该系统使用分子量为44 kDa的聚氧化乙烯 (SE-5) 进行校准。洗脱液中SE-5溶液的浓度为1.6 mg/mL，色谱柱中的注入量为100 μL。SE-5比折光指数增量 (dn/dc) 为0.132 mL/g。

分析结果

图1是普鲁兰1和葡聚糖1的RI色谱图。从洗脱曲线来看，普鲁兰1比葡聚糖1更早洗脱出来，表明葡聚糖1的流体力学体积（Vh）小于普鲁兰1。而样品的分子量分布显示（基于光散射），葡聚糖1的分子量更高。

从样品的洗脱和分子量分布曲线，我们可以得出结论，葡聚糖1的质量尺寸比（密度）高于普鲁兰1，表明葡聚糖1的分子密度因分支而增加。

图1 葡聚糖1和普鲁兰1样品的色谱图

为进一步研究该假设，我们在相同的实验条件下，分析了一组分子量从21 kDa到915 kDa的线性普鲁兰标准品。表1是使用SECview软件测定的普鲁兰标准品的回转半径（Rg）。从技术上来讲，传统的MALS检测器无法通过检测散射光的角度依赖性来测量12 nm以下尺寸的Rg值。而LenS3 MALS检测器的测量范围更广，可以测量Rg值更小的聚合物。这里，最低可测量普鲁兰标准品（分子量为21 kDa）的Rg值为5.1 nm。

表1 葡聚糖和普鲁兰样品的分子量和Rg值

图2构象图显示，普鲁兰标准品的Rg和分子量之间的相关性呈线性，斜率为0.57，符合良好溶剂中无规线团聚合物的预期。普鲁兰1的分布更加广泛，其分布结果正好落在外推的构象图上。

图2 普鲁兰和葡聚糖的构象图

除线性普鲁兰标准品外，我们还分析了不同分子量分布的葡聚糖，其结果见表1和图4。低分子量葡聚糖（葡聚糖2）Rg值的整体分布与普鲁兰的构象图完全重合。该关系是分子密度的指标，表明低分子量的葡聚糖与普鲁兰具有相同的线性结构。相反，葡聚糖1和葡聚糖3的Rg与分子量关系的斜率分别为0.22和0.35。其斜率值比线性普鲁兰小得多，表明其结构相对较密。

线性普鲁兰在洗脱液中形成的是无规线团结构。而葡聚糖，如前所述，特别是高分子量的葡聚糖中可能存在长链分支。因此，溶于洗脱液时，会形成一个更紧密的无规线团结构。该紧密结构会导致分子尺寸更小，因此从色谱柱中洗脱的时间更长。

研究结论

使用SEC-MALS分析可以深入研究聚合物的结构差异。如本应用中所示，高分子量葡聚糖的主干上通常存在更多的分支，导致其在溶液中会形成更紧密的结构。因此，与相似MW的线性普鲁兰相比，其保留体积更高且Rg值更低。实践操作时，若要阐明低分子量和低Rg区域的结构变化，需要配备一台像LenS3 MALS这样具有高灵敏度的光散射检测器，并能够检测极细微的各向异性散射。