专家述评 | 陆军军医大学第二附属医院杨可/赵景宏团队4D蛋白组揭示肾脏Klotho调控血小板寿命新机制

2022-12-15 07:16:05, 景杰生物杭州景杰生物科技股份有限公司

景杰生物 | 报道

血栓形成和出血是两种相反的病理现象，在慢性肾脏病 (Chronic kidney disease, CKD) 患者中普遍存在。血小板稳态包括血小板数量和血小板功能，是血栓和出血性并发症的核心影响因素。然而，血小板稳态在CKD人群中有所不同，而造成其不同的潜在机制也是知之甚少。

Klotho是一种主要由肾脏分泌的抗衰老蛋白，其缺乏不仅是CKD的共同病理特征，而且与出血等CKD心血管并发症密切相关。尽管肾脏分泌的Klotho蛋白作为一种循环因子，可广泛作用于血小板等多种肾外细胞，但其在CKD内环境下对血小板稳态调控作用尚不明确。

2022年9月6日，陆军军医大学第二附属医院杨可/赵景宏团队在Journal of Thrombosis and Haemostasis (IF=16.036) 发表了题为Renal Klotho safeguards platelet lifespan in advanced chronic kidney disease through restraining Bcl-xL ubiquitination and degradation 的最新研究成果[1]。该研究结合4D蛋白质组学技术，揭示了在晚期CKD (Advanced CKD，Adv-CKD) 内环境下， p38MAPK-UBE2O轴介导Bcl-xL泛素化和降解，缩短血小板寿命和导致血小板数量下降。而肾脏Klotho蛋白可有效地抵消这种有害作用。研究揭示了Adv-CKD中血小板数量下降的机制，并确定肾脏Klotho是血小板寿命的远程调节因子，为治疗CKD相关的血小板减少和出血提供了一个有前景的策略。

陆军军医大学第二附属医院蓝琦港和陆军军医大学防原医学教研室杜长虹为本文第一作者，陆军军医大学第二附属医院杨可和赵景宏教授为本文通讯作者。景杰生物为该研究提供了4D蛋白质组学分析技术支持及泛素化修饰抗体。

1. 肾脏Klotho正向调控Adv-CKD环境下血小板寿命

首先，研究者招募了305名2-5期CKD患者证明了血清Klotho水平与血小板数量呈正相关。由于血清Klotho水平与肾功能呈正相关，这些结果进一步证实了Adv-CKD与血小板数量下降相关。研究人员随后通过对Klotho缺乏 (Klotho^+/-) 小鼠进行5/6肾切除，建立了Adv-CKD小鼠模型。在模型小鼠中血小板计数明显降低，而可溶性补充Klotho几乎消除了这一效应。值得注意的是，血小板并不表达Klotho，而循环中的Klotho主要由肾脏分泌，这些结果表明肾脏Klotho可正向调控Adv-CKD中血小板数量。

血小板生成和寿命是决定血小板数量的主要因素，研究者通过体内和体外实验发现Adv-CKD促进巨核组细胞和成熟巨核细胞比例增加，然而这些结果并不能解释血小板数量在Adv-CKD中降低。随后研究者通过流式细胞术检测血小板清除情况以确定血小板寿命，结果显示Adv-CKD患者和小鼠中血小板清除显著加快。此外，研究者通过移植实验发现了Adv-CKD内环境诱导血小板寿命缩短是自主的和不可逆的。相反，可溶性补充Klotho显著促进血小板寿命回升，表明肾脏Klotho可正向调节AdvCKD中的血小板寿命。

图1 肾脏Klotho正向调控Adv-CKD环境下血小板寿命

2. 肾脏Klotho通过拮抗Adv-CKD诱导的Bcl-xL下调延长血小板寿命

为了揭示Adv-CKD环境下血小板寿命缩短的潜在机制，研究者通过分离血小板进行4D蛋白质组学分析，发现了线粒体功能障碍相关蛋白显著富集，并通过实验证实了Adv-CKD血小板线粒体膜电位降低。线粒体功能障碍与内在凋亡信号通路的激活密切相关，其激活可抑制血小板存活，从而导致血小板寿命缩短。对线粒体完整性相关的凋亡蛋白进行分析，发现Adv-CKD血小板内抗凋亡蛋白Bcl-xL显著下调。而可溶性补充Klotho显著消除了Adv-CKD诱导的Bcl-xL下调，从而保护血小板线粒体完整性和促进血小板存活。表明肾脏Klotho可通过拮抗Bcl-xL下调改善Adv-CKD诱导的血小板寿命缩短。

图2 AdvCKD通过促进Bcl-xL的下调来缩短血小板寿命

3. 肾脏Klotho抑制UBE2O介导的Bcl-xL泛素化和降解

虽然血小板是无核的细胞碎片，其蛋白质合成能力有限，但血小板拥有成熟的蛋白翻译后修饰和降解机制。蛋白质组学分析提示蛋白泛素化途径变化强烈，从而加速了蛋白酶体对蛋白质的降解。研究者发现在Adv-CKD环境下Bcl-xL泛素化水平上升，而蛋白酶体抑制剂MG-132处理后Bcl-xL水平回升和延长血小板寿命，提示Bcl-xL的泛素化和蛋白酶体降解是Adv-CKD诱导血小板Bcl-xL下调的主要原因。进一步分析蛋白质组学结果发现，UBE2O是血小板中最丰富的泛素连接酶。研究也进一步证实了UBE2O与Bcl-xL在Adv-CKD环境下结合升高。相反，可溶性补充Klotho可抑制AdvCKD诱导UBE2O结合Bcl-xL和Bcl-xL泛素化。

图3 肾脏Klotho抑制UBE2O介导的Bcl-xL泛素化和降解

4. 肾脏Klotho通过抑制p38MAPK激活减轻UBE2O介导的Bcl-xL泛素化

最后研究者发现Adv-CKD血小板内活性氧生成增加和p38MAPK激活促进Bcl-xL磷酸化，使其更容易被泛素连接酶识别。可溶性补充Klotho可显著抑制p38MAPK磷酸化。而使用p38MAPK抑制剂SB203580处理后显著抑制Bcl-xL磷酸化、UBE2O结合Bcl-xL和Bcl-xL泛素化，从而促进血小板存活和寿命延长。结果提示Adv-CKD诱导的p38MAPK激活促进了血小板Bcl-xL泛素化，肾脏Klotho可改善这一效应。

图4 肾脏Klotho通过抑制p38MAPK激活减轻UBE2O介导的Bcl-xL泛素化

综上，该研究发现在Adv-CKD环境下血小板数量降低的细胞和分子机制，并证实肾脏Klotho作为远程调节因子可拮抗这一效应。该研究不仅极大地促进了对CKD血小板寿命的调节机制和血小板疾病的发病机制的理解，而且为肾脏与造血系统的相互作用提供了新的见解。

专家评述

Journal of Thrombosis and Haemostasis 同期发表了山东大学彭军教授题为Klotho, a protective renal factor for platelet lifespan 的评述，指出该研究为AdvCKD中血小板计数下降的细胞和分子机制提供了有价值的新信息，并提供了有前景和有价值的干预措施。

CKD患者的凝血障碍病因十分复杂，其中血小板处于中心地位。除血小板功能外，血小板数量对止血功能的维持也同样重要。Adv-CKD患者的血小板数量有轻度减少，而其潜在机制及其病理意义尚未明确。Lan等人使用了多管齐下的方法来检测Adv-CKD对血小板生成和血小板寿命的影响，并提供了令人信服的数据说明了AdvCKD可诱导血小板寿命缩短的，并得出结论：血小板寿命自主的、不可逆的缩短是Adv-CKD中血小板数量下降的重要原因。

该研究还观察到CKD患者的血清Klotho水平与血小板数量呈正相关。由于血小板不表达Klotho，研究者假设Klotho可能在本质上影响血小板的寿命，并证实了可溶性Klotho治疗缓解了Adv-CKD诱导的血小板寿命缩短。这些发现是令人兴奋的，因为这是第一个报告表明了血小板寿命可以通过器官间的方式被一个远程的因子调节。

从分子角度来看，该研究证明了血小板Bcl-xL的下调介导其寿命缩短，这归因于其增强的泛素化和蛋白酶体降解功能。此外，该研究的亮点是首次证明了UBE2O是负责Adv-CKD诱导的Bcl-xL泛素化的主要泛素连接酶，并证明活性氧的过量产生是由促氧化Adv-CKD环境诱导的，随后激活p38MAPK磷酸化Bcl-xL，以促进其被UBE2O识别。而Klotho清除血小板活性氧，保护AdvCKD血小板寿命。这些发现大大促进了我们对血小板寿命的内在和外在调节机制的理解，并为管理这些情况下的血小板病理改变提供了一个很好的范例。

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参考文献

1. Lan, Q., et al.,2022. Renal Klotho safeguards platelet lifespan in advanced chronic kidney disease through restraining Bcl-xL ubiquitination and degradation. J Thromb Haemost.

2. Jun Peng. 2022. Klotho, aprotective renal factor for platelet lifespan. J Thromb Haemost.

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