2022-12-13 07:44:35, 锘海生命科学 锘海生物科学仪器(上海)股份有限公司
随着生物医学的快速发展,越来越多的科学研究和临床应用,对生物组织高分辨率三维成像提出了新的需求,比如肿瘤微环境、神经投射、脉管系统等生命科学的研究,都需要生物组织完整的三维结构信息。由于生物组织不透明,传统对生物组织三维成像的方法,依赖于组织切片的方式来完成,但是这种方式操作繁琐,且成像通量低。因此,基于机械切片的技术方式越来越不能满足当下的研究现状,随着组织透明化技术和光片显微成像的结合,正式打开了三维结构可视化研究的大门。
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案例分享:
► 以往研究脊柱淋巴网络的信息很少,因为这些精细的结构嵌入在椎体组织中,很难用传统的组织学观察。2019年发表在Nature communications一篇题为“Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice”的文章成功探究了小鼠脊柱淋巴网络的结构与功能。在文章中,作者首先通过对脊柱节段采用iDISCO+方法进行免疫染色及透明化,结合一定的脱钙处理,并利用光片荧光显微镜进行成像,发现脊柱椎管内有广泛而复杂的淋巴管系统。
原文Fig.2经PROX1抗体染色的透明化胸椎,展示脊柱淋巴管系统的模块化结构。
原文Fig.8 采用LYVE1(绿色)和CD45(紫色)抗体对透明化后的颈椎节段进行双标记,表明脊髓淋巴管与免疫细胞的相互作用。
原文Fig.S1透明化胸椎的淋巴和血管系统。a、b透明化的胸椎节段进行PROX1(白色)/LYVE1(红色)双染色以识别淋巴管。c-h用LYVE1(绿色)和Podocalyxin(紫色)双标记以识别血管。
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透明化染色方法流程:
►文章使用了Renier及其同事开发的一种透明化方案,该方案基于甲醇脱水,并称为对溶剂透明化的器官进行免疫标记的三维成像(iDISCO+, http://www.idisco.info )。梯度增加的甲醇浓度会导致适度的组织收缩(约10%),以及组织的“透明度”增加:
1. | 经过固定的样品分别在20、40、60、80、100% 甲醇/PBS中逐步脱水1h。 |
2. | 然后将其在33%甲醇/66%二氯甲烷(DCM)的溶液中孵育过夜。 |
3. | 用100%甲醇洗涤2 × 1 h后,样品用5% H2O2甲醇(1 vol 30% H2O2/5 vol甲醇)在4℃漂白过夜。 |
4. | 漂白后,样品分别在80、60、40、20%甲醇、PBS中再水化1 h。 |
5. | 为了透明化脊柱,文章中添加了一个使用莫尔斯溶液的脱钙步骤,在室温下孵育30分钟。使用莫尔斯溶液(1/1柠檬酸钠和45%甲酸)的弱酸处理可以有效地对组织脱钙,同时保留其结构。 |
6. | 用PBS快速洗涤样品,然后在PTx2 (PBS/0.2% Triton X-100)中孵育2 × 1 h。在这一步后,对样本进行免疫染色处理。 |
7. | 样本在PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M甘氨酸中,37℃孵育24 h。 |
8. | 然后在PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6%驴血清中,37℃封闭24 h。 |
9. | 样品在PTwH (PBS/0.2%吐温-20与10 mg/ml肝素)/5% DMSO/3%驴血清的一抗稀释液中,37℃孵育6天。 |
10. | 样本在PTwH中洗涤5次直至次日。 |
11. | 然后在PTwH/3%驴血清二抗体稀释中,37℃孵育4天。 |
12. | 最后在PTwH中洗涤5次直至次日。 |
13. | 然后将样本在33%/DCM 66%甲醇溶液中孵育过夜。 |
14. | 随后在100% DCM中孵育2 × 15 min以洗涤甲醇。 |
15. | 最后,样品在二苄醚(DBE)中孵育,直到透明化(约4 h),即可成像。 |
参考文献:
Jacob L, Boisserand LSB, Geraldo LHM, et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nat Commun. 2019;10(1):4594.
Renier N, et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 2014;159:896–910.
Morse A. Formic acid-sodium citrate decalcification and butyl alcohol dehydration of teeth and bones for sectioning in paraffin. J. Dent. Res. 1945;24:143–153.
Shibata Y, Fujita S, Takahashi H, Yamaguchi A, Koji T. Assessment of decalcifying protocols for detection of specific RNA by non-radioactive in situ hybridization in calcified tissues. Histochem. Cell Biol. 2000;113:153–159.
González-Chávez SA, Pacheco-Tena C, Macías-Vázquez CE, Luévano-Flores E. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013;6:1972–1983.
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