浅谈时间分辨荧光技术

荧光寿命是一种分子性质，通常与荧光团浓度、激发光强度等条件无关，而与其自身结构和所处的微环境，例如温度、极性、pH 值等有关，时间分辨荧光（TRF）检测技术正是利用该性质，在荧光寿命维度来区分样品信号。常规的 TRF 技术有两条主要技术路线，分别是荧光寿命成像（Fluorescence Lifetime Imaging，FLIM）技术和时间分辨荧光免疫分析（Time-Resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）技术。

荧光寿命成像 FLIM 技术于 1989 年首次由 I. Bugiel 等人^[2]报道，利用亚纳秒时间分辨荧光激光扫描显微镜成功实现了细胞水平的研究。近几十年该技术发展出了以 CCD 相机或者超高速相机为基础的宽场成像和以脉冲激光为基础的共聚焦成像两大类，并基于时域和频域的原理形成了多种 FLIM 技术，但均拥有鲜明的优缺点。除结构复杂导致的系统搭建难度较大以外，要么分辨率和信噪比较高但难以测量动态样品，要么采集速度快但对样品信号强度有要求。市面上成熟的商业化方案也较少，Leica Microsystem 推出的 FALCON 荧光寿命成像系统为其代表。

时间分辨荧光免疫分析 TRFIA 技术则是将时间分辨荧光与免疫分析技术相结合，属于一类非放射性标记技术。TRFIA 以三价镧系元素离子或其螯合物，例如铕（Eu）、铽（Tb）、钐（Sm）和镝（Dy）为标记物，来代替常用的荧光物质对抗原抗体进行标记，并使用带有时间分辨荧光检测功能的仪器如酶标仪来对荧光强度信号进行检测，最终绘制标准荧光曲线，定量分析待测物的浓度。

图1 时间分辨荧光免疫分析技术基本原理

对一些常见的荧光基团来说，其荧光寿命普遍处于 10-100 ns 左右，而镧系元素及其螯合物的荧光寿命可达 10³-10⁶ ns，因此在检测信号时（图 1），利用两次激发光脉冲的间隔，等待杂散信号的寿命衰减之后再进行荧光强度的检测，可以大大减少其他信号的干扰，提高信噪比和灵敏度。

在稀土元素的选择上，铕的三价离子（Eu³⁺）在生物研究领域最为常用，其荧光寿命约 1ms，激发光波长通常在 330nm 左右，发射光波长通常在 610nm 左右，引入适当的配合物系统以后，能使铕在水溶液中更加稳定，并且荧光强度可增强数十倍^[3]。而铽的三价离子（Tb³⁺）配合物的激发光波长通常在 290nm 左右，发射光波长通常在 540nm 左右，该发射光波段处于许多常见生物荧光基团的波段范围内，且热动力学稳定性较差，并具有一定的细胞毒性，因此与铕离子相比在生物领域使用略少，但在材料学领域使用前景广阔。此外钐（Sm³⁺）也偶有应用，比如铕与钐的双标记。

随着 TRFIA 的应用逐渐广泛，其中一类衍生技术也逐渐被大家所熟知，即均相时间分辨荧光 HTRF （Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）。该技术将时间分辨荧光 TRF 和荧光共振能量转移 FRET 相结合，使用铕（Eu³⁺）或铽（Lumi4 - Tb）的穴状化合物作为供体，荧光团（ XL665 或小分子 d2 ）作为受体^[4]。当供体和受体距离足够近时，供体被一个能量源激发，可以引发能量转移到受体，使其在特定波长发出荧光，用于检测生物分子之间的相互作用。

Molecular Devices 公司旗下 M 系列、iD5、i3x、Paradigm 等多款型号的多功能酶标仪均可配备 TRF 检测功能，并提供经 Cisbio 认证的 HTRF 功能模块可供选择，获得高灵敏度和宽动态范围的数据。