Nature 文章分享会 | 解密课题研究思路设计与发文经验

请简述一下克隆基因的过程。

无数次的尝试和每一步的办法，第一点最难的是野生玉米的序列，做了很多无用功。王文琴老师领导了基因组的解析，这对于课题研究推进是非常重要的。第二点是课题组在每一代中的构建都是非常认真的，为避免花粉交叉污染，每一株玉米都有亲自授粉。在这之中如何去突破，刚刚讲到了BC3、BC6、BC8，先在欧易生物去做了很多很多的BSA测序，查找高蛋白的位点，通过重测序进一步缩小范围，最后通过图位克隆去进一步的验证。其实课题组也是把所有渗入的基因都分析了。如何去克隆是一个非常漫长的过程，这也是课题组做了十代遗传材料构建的原因。

想问这个F1和B73 有很多相同的序列，这个都被剔除掉了吗？那么野生种的同源序列怎么办呢？

可以让目前在欧易生物工作的小伙伴来做解答，也是他们一步一步去做的。

我们对野生玉米TEO和B73做杂交，使用F1代植株进行三代测序，拿到的三代序列是既有来自野生玉米TEO的也有来自B73的，因此，我们必须要对这些序列做拆分，这里我们使用的是Trio-Binning的组装方式。我们首先使用来自两个亲本基因组的高精度短读长数据（二代测序数据）将F1代的长读长序列划分为单倍型特异性的集合，在划分单倍型特异集合的过程中，野生玉米TEO和B73不同的序列会被拆分为各自两部分集合，而相同的部分各自都会保留，然后我们对每个单倍型独立组装，形成一个完整的二倍体重建。

想请教蛋白的工作，这个蛋白跑胶怎么锚定到这个目标蛋白的呢？这个看似是早于图位克隆的工作。 

蛋白最先是一团的，但是它是带电荷的，我们先把蛋白提取出来，通过在缓冲液下，因为不同蛋白大小不一样，将层析出来一条一条的带，再进行染色，通过看条不同带颜色的深浅和大小来进行鉴别，可以判断蛋白含量的高低。

杂交F2种子蛋白含量是F1和B73种子蛋白的2倍，不符合孟德尔遗传规律，是母性遗传，能麻烦老师再解释一下吗？

因为F1结的种子是F2，F1是B73和野生玉米做的杂交获得的，首先需要和大家普及一下，野生玉米具有单向不亲和的特征，只能将它的花粉授到B73上，因此F1植株便携带了一半的野生玉米的基因序列。因为野生玉米是高蛋白的，即携带了高蛋白基因的，而杂交到B73后，F1植株就携带了野生玉米杂交过来所有高蛋白基因位点，我们后面分析表明高蛋白形成的原因是植株具有更强的氮的吸收同化能力，所以F1植株结的种子F2都是高蛋白的。

您谈到野生种好多基因是多copy和串联重复很多，您是否有发现在玉米野生种中确实贡献其他性状，对于这些基因研究上有什么好的方法开展？ 

第一个问题，对于好多基因是多copy和串联重复很多，对应产生的生物学意义，我们这篇文章没暂时还没去做。我们这篇文章对于串联重复序列解析主要是针对我们研究的醇溶蛋白拷贝分析。第二个问题，现在我们有这么好的基因组，你想研究的序列都可以提取出来进行分析，在这么好的野生玉米基因组的支持下，对生物学很多重要农艺性状形成的基础研究是一个非常好的帮助，是未来的一个宝库。

THP9基因在玉米驯化过程中会丢失掉的原因可能是什么？

我们在文章中也有做这样的讨论，由于现在人们施的氮肥都是过量的，因此没有存在这种压力，所以这个这个基因没有被定向的选择下来；设想下当氮肥施加很少的时候，这个基因就就能表现出它的优势了。