用FlowCam进行集群和丝状蓝藻的细胞计数：方法和案例研究

追踪有害藻（HAB）生长

准确地确定集群和丝状蓝藻的细胞计数，如微囊藻和鱼腥藻是监测潜在毒性蓝藻的关键。传统的方法，包括手工显微镜检查，耗时、繁琐、容易出错、难以验证。

在2017年3月的《有害藻类》杂志上，来自加州水资源部门的科学家描述了他们如何使用FlowCam^®估计微囊藻的细胞丰度。这个技术简报解释了他们的方法，也适用于丝状蓝藻。

图1。集群藻类(微囊藻)和丝状藻类(Anabaena)可以使用FlowCam及其分析软件VisualSpreadsheet^®枚举。每张图片下方标注菌落面积(ABD) (μm²)。

样品采集与制备

以下节选自Lehman et al.(2017)，《2014年严重干旱对旧金山河口微囊藻爆发的影响》，《有害藻类63:94-1208》，描述了他们样品的收集和制备。

用Lugol溶液保存所要测定生物体积的微囊藻的两个样品(>75 μm粒径)。微囊菌落的生物体积是使用FlowCam数字成像流式细胞仪(Fluid imaging Technologies；Sieracki et al.，1998)检测获得Area (ABD)。为了更方便地测量集群藻的生物体积，将样品分成直径<300 μm的馏分，并在10倍和4倍放大下检测。>300μm样品在2倍放大下分析。基于FlowCam测量的细胞丰度结果与显微分析的结果密切相关(r=0.88,p<0.01)。

采用0.3m深度的全水(未处理)样品，测定了次地表水中浮游植物和蓝藻的生物体积和分类组成(>10 μm粒径分数)。这些样本保存在4℃，并在FlowCam数字成像流式细胞仪上保存1到3小时。FlowCam安装了一个荧光触发器，可以从碎屑中分离活的浮游植物(Sieracki et al.，1998)。将样品置于100 mL在10分钟内通过流通池中，采用10倍放大1，以此获得细胞的数字图像。

计算细胞密度：集群藻类

Lehman等人使用以下方法计算了含有集群微囊藻样品的细胞密度(细胞/mL)。

首先，测定微囊藻菌落中单个细胞的平均面积。从VisualSpreadsheet列表文件中选择集群(图2)，用VisualSpreadsheet计算菌落的面积(Area, ABD)除以图像中人工计数的细胞数(图2)。

图2。微囊藻集群在VisualSpreadsheet软件中显示的图像。图下标注了每个集群的面积(ABD) (μm²)。下面的计算中使用了绿色突出显示的菌落图像。人工计数显示，每个高亮集群从左到右分别有4、6、13和28个微囊细胞。

在列表(LST)文件中分离出微囊藻后，将该文件导出至Excel，作为分类总结报告。在Excel单元格中输入以下公式，计算样本的平均细胞密度:

计算细胞密度：丝状藻类

计算集群藻细胞密度的方法也可用于计算丝状蓝藻(包括鱼腥藻的细胞密度。

为了确定单个细胞的面积(ABD)，将鱼腥藻丝的面积(ABD)除以图像中细胞的数量。

利用VisualSpreadsheet文件中的图像(图3)，确定Anabaena细胞的平均面积(ABD)为48 μm²。

在VisualSpreadsheet列表(LST)文件中筛分出鱼腥藻之后，数据被导出到Excel中，作为分类总结报告。将如下公式输入到Excel细胞中，计算丝状藻样本的细胞密度:

细胞丰度被用来追踪藻华生长。使用上述方法，FlowCam可以用来计算集群或丝状蓝藻藻华的细胞丰度。