制备色谱的使用

之前我们也写过关于制备色谱的文章，今天就说说制备色谱的使用。

制备型(Prep)色谱或纯化色谱则是指利用色谱方法分离出一定量达到足够纯度的化合物用于后续实验或处理的过程。科学家首先要确定目标化合物，然后开发色谱方法，将目标化合物从原料、副反应或其他杂质中成功分离出来。其总体目标是满足日益增长的高通量和高效率需求，同时运用各种纯化技术达到相应的规模、纯度和重现性要求。

LC纯化系统的配置与一般液相色谱系统相同，但增加了馏分收集器。样品混合物被进样至色谱柱，色谱柱根据组分特有的化学或物理性质对其进行分离。检出组分时，系统会将其输送至废液，或者进行收集用于后续实验。洗脱液收集操作既可由分析人员在组分洗脱时通过简单的手动方式完成，也可以全自动进行，在自动收集操作中，检测器信号会触发馏分收集器将液流输送至收集容器中。输送至收集容器的馏分纯度取决于分离过程中化合物与其他邻近洗脱杂质的分离度。

判断纯化分离成功与否的标准包括通量、回收率和所得分离物的纯度。纯化分离由色谱峰的分离或“分离度”驱动。以下是对分离度有显著影响的主要色谱参数：

通过执行方法开发工作流程，可确定实现理想分离度的条件。该工作流程非常简单，但包含多个步骤，各步骤的复杂性和必要性根据样品的独特性质而异。无论样品分离用于何种应用、采用哪种模式（即反相色谱、离子交换色谱等），方法开发工作流程通常都是相同的。

各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小，且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。

不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。如果，只有很小的分离任务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状态，对有色的物质其特点就更为突出。

根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大，颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说，颗粒直径小于20－30um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击－装填”技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的 固定相悬浆以高速装入色谱柱子，从而减少空隙的形成。然而，当柱直径大于20mm，所加压力为30－40bar时，高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱，可采用柱长压缩技术。这种方法，先将固定相悬浆（或偶尔是干填充物）装入柱中加压，利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种：径向压缩和轴向压缩。湿法装柱需要一定的设备，在柱子填完后，应用有柱效的测量，对柱效低的柱子应该重填。

除了和分析色谱同样的考虑外，在选用流动相时，要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说，不宜采用高毒性溶剂，对多元溶剂要尽可能的少用。如果产品中含有大量溶剂，溶剂的纯度也要考虑在其中。

用分析柱子在同等色谱条件下（同样的固定相和流动相）测定保留时间后，按照单一组分的线流速（不是体积流速）一定，通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。分析谱图的峰形状，对确定保留时间也有很大的参考价值。

可用于分离特定化合物的样品来源十分广泛，包括药物中间体、天然产物、保健食品、饮料和工业产品等。只要原料可以进行提取并溶解于液体基质中，就可以使用色谱纯化其中的各组分。收集提取物之后，和所有HPLC样品一样，样品在进样前必须过滤，以除去颗粒并排除气泡。

制备型色谱主要有四种分离模式：反相、正相、凝胶渗透和离子交换。合适的分离模式取决于待分析样品、提取物或混合物与固定相和溶剂之间的相容性。

反相色谱是开发纯化方法时最常用的技术，其使用极性弱于洗脱溶剂极性的固定相。反相色谱使用水与乙腈或甲醇的混合物作为洗脱液，其中还会添加缓冲液（酸或碱）用于控制样品的离子化程度以及结合固定相中未反应的游离硅醇基团。硅胶基质固定相中的键合相材料或吸附剂采用甲硅烷基化试剂进行了衍生化处理，可减少峰拖尾并提高色谱重现性。上述衍生化试剂处理（硅烷化）以及不同的碳载量将赋予不同制造商的色谱柱独特的分离特征。