基于诱导多能干细胞的基因编辑和细胞治疗

ZFN技术已经成功应用于人iPSCs的基因编辑，包括疾病特异性iPSCs和正常人的iPSCs，疾病特异性iPSCs包括血液疾病、神经系统疾病等遗传病。目前研究人员研究建立了α-地中海贫血病人特异性的iPSCs，并利用ZFN技术在安全位点插入野生型globin，获得包含正常globin的iPSCs，基因编辑后的iPSCs分化形成的红细胞表达正常的β-球蛋白。此外，利用ZFN技术可修复镰刀型细胞贫血的致病基因，经基因修复后的iPSCs分化形成的红细胞表达正常的β-球蛋白。利用ZFN技术进行基因编辑的疾病特异性iPSCs还有神经系统疾病如帕金森氏病等。除了用于校正疾病特异iPSCs，ZFN技术还可以用于编辑正常人的iPSCs，在特定位点插入荧光蛋白来监控、追踪细胞的存活情况或基因的表达情况，或在安全位点插入抗生素基因建立人类胚胎干细胞药物诱导过表达体系。

ZFN技术提供了一种快速对基因进行编辑的方法，但是其发展还存在一定局限。首先，ZFN存在依赖效应，因此ZFN设计和筛选效率大大降低，高昂的成本及繁琐的程序限制了其成为实验室常规技术；其次，ZFN的脱靶效应会导致其他DNA位点的错误切割，产生较强的细胞毒性，造成细胞的死亡，使得其在基因治疗领域中的应用受到限制。

利用TALEN技术对iPSCs进行基因编辑，包括疾病特异性iPSCs致病基因的修复和在正常iPSCs中插入荧光蛋白基因或者抗性基因等。除了和ZFN技术相似地建立了地中海贫血特异性iPSCs细胞系和镰刀型细胞贫血特异性iPSCs细胞系外，TALEN的另一重要应用是可以在细胞中插入各种标记基因对细胞进行进一步深入的研究，如在细胞中插入绿色荧光蛋白等标记基因来监控细胞特定基因的表达情况，或者在细胞中插入抗性基因对细胞进行筛选等。

与ZFN技术相比，TALEN技术效率更高，而且对细胞的毒性也更小。TALEN技术中的TALE蛋白的两个氨基酸残基对应一个碱基，识别DNA特异性位点比ZFN要高。TALEN技术也存在一定缺陷，经TALEN处理以后的细胞克隆与克隆之间单核苷酸多态性位点存在一定程度的差异，虽然不影响TALEN的使用，但是也不可忽视。

CRISPR/Cas技术多用于正常人ESCs和iPSCs的基因编辑，如在内源基因中产生特定的突变用于建立罕见疾病特异性的细胞模型、插入药物诱导调控的启动子来调控细胞的分化或者在安全位点插入报告基因用以测定同源重组修复效率等。研究人员利用CRISPR/Cas9技术成功地修复了杜氏肌营养不良（DMD）致病基因。

CRISPR/Cas系统的构建比ZFN和TALEN系统的构建要简单和廉价，普通实验室也可自行构建，大大提高了基因操作的简便性。然而CRISPR/Cas系统碱基配对序列较短，可能导致CRISPR/Cas系统切割特异性降低，还需要进一步的改进与完善。

iPSCs用于移植主要有两种方法，一种为直接移植iPSCs，移植后在体内周围环境的影响下分化成特定种类的细胞；另一种是在体外将iPSCs分化形成某种特定类型的细胞或者组织器官后再进行移植。两种方法在模式生物中的应用均有报道。

对遗传病和基因突变导致的疾病最好的方法是校正基因的致病突变，此方法在人的细胞中尚未见报道，但是在小鼠中已有报道。据报道，将小鼠的成纤维细胞重编程为iPSCs后，再用同源重组的方法用人野生型βa-珠蛋白基因代替βs-珠蛋白基因，最后诱导遗传修饰后的iPSCs定向分化为造血祖细胞（HPs），并将其移植到镰刀型细胞贫血小鼠体内。结果显示，HPs可有效抑制镰刀性红细胞贫血症症状。对疾病特异性iPSCs进行基因编辑校正其致病基因，进一步分化成特定类型的细胞并用于细胞治疗，为遗传病患者带来了新的希望。