AI 助力无标记肠道类器官表型分析

2022-11-18 21:10:31, 吴小燕 美谷分子仪器(上海)有限公司



三维 (3D) 模型,如细胞球和类器官在许多研究领域越来越受欢迎,因为它们与单层 2D 培养模型相比更能代表体内环境。类器官培养技术取得的最新进展使得我们能够利用诱导多能干细胞(iPSC)或成体干细胞制作 3D 类器官模型。小肠是一个快速更新的组织,具有高更新速率。其主要组成是单层的上皮细胞,隐窝和绒毛交替(图 1 )。这些隐窝,或肠道延伸,含有分裂并产生祖细胞的干细胞。因此,隐窝是肠道类器官的重要组成部分,成熟的肠道类器官具有更复杂的和众多的隐窝结构。

优势

  • 通过一步步导向式的工作流程,简化了高内涵的成像过程

  • 在 SINAP 模块中创建了深度学习模块用于分割无标记的肠道类器官

  • 创建了分类规则以分类识别的类器官,且该流程对用户友好

许多类器官的应用领域包括利用高内涵的方法进行药物发现和药物再利用。这里我们使用 ImageXpress Pico 自动化细胞获取和分析系统拍摄肠道类器官。CellReporterXpress 软件通过内置不同应用方向的操作模板降低高内涵成像的复杂程度。例如,新的孔板拍摄和拼接孔板拍摄是两个常见的成像拍摄模板,导向式的工作流可以使成像小白轻松设置自己的拍摄程序。被用户修改后的模板可以被保存,方便用户后期一键调取成像。


CellReporterXpress 软件的易操作性超越了图像获取,强大的图像分析软件支持实时分析。用户可以在 25 种预设模板中选其一,这些模板中包含了常见的图像分析工具,如细胞计数,活死细胞分析,神经追踪,血管生成等。除了其流程的简化,CellReporterXpress 用户也可以启用高级图像分析通过调用人工智能 IN Carta 图像分析软件。IN Carta 中包含细胞核,细胞,微粒,纤维和神经等常见生物结构分割的成熟算法,同时也可选择 SINAP 模块,一个基于深度学习的分割工具,可以使用户创建个性化的神经网络模型。基于机器学习算法的分类模块可根据用户手动挑选的分类逻辑做分类。


在本篇应用中,我们描述了用于成像和成像分析的常见方法,以检测类器官形态和表型的变化。该方法适用于任何类器官,无论是原始的或改进的模板。除此之外,我们展示了用 ImageXpress Pico 自动化细胞获取和分析系统,CellReporterXpress 软件和 IN Carta 图像分析软件成像和分析肠道类器官的流程。尤其是 IN Carta,SINAP 图像分割后可再进行图像分类。使用该方法,我们呈现了一个简单的流程去成像,分析和分类肠道类器官,成功将其划分为未成熟,中间态和成熟类器官。这种 AI 赋能的分类方法可以用于监测培养中的肠道类器官的生长和发育。

 

方 法

类器官成像

常规的类器官成像流程如图 2 所示。类器官的透射光(TL)图像通过 ImageXpress Pico 系统的 CellReporterXpress 获取。Z-stacking 图像的 2D 投影利用 10x 物镜,10µm 聚焦步进以及孔底自动聚焦完成。焦点偏移距离由 CellReporterXpress. 软件自动定义。


图像分析

图像由 CellReporterXpress 导出为 IN Carta 兼容的图像模式。SINAP,基于深度学习的分割模块,通过多组图片训练创建了一个强大的用户自定义的模型。新训练的模型随后被用于分析所有的图片。 Phenoglyphs,基于机器学习的工具,被用于分类所获得的类器官,将其划分为未成熟,中间态和成熟。

图 1 . 肠道类器官的 2D 卡通结构示意图


图 2. 工作流程

 

结果

CellReporterXpress 

获取的 2D 投影和 3D 层扫图片

小鼠肠道类器官图片通过拼接孔板拍摄模板拍摄得到,该模板会将一个孔内的所有视野生成一个拼接的大图。由于肠道类器官的 3D 特性,选择了 Z-stacking 模式并选择合适的 z 轴范围去覆盖整个类器官。CellReporterXpress 针对透射光通道提供不同的 Z 轴投影选项(average,best plane,best focus smaller objects and best focus large objects)。average Z-projection 是平均所有层面的荧光强度,best plane 是选取最佳聚焦的一层,而另外两个则将图像分割成小区域,为每个区域在所有 z 平面上找到最佳焦点。这里我们使用并比较了 4 个方式,其他成像系统会以 best focus 为最佳选项,不同于其他系统,best focus smaller objects 和 best focus large objects 相比于 average  和 best plane 的方法有更卓越的图像质量(图 3)。由于胶质中类器官的深度随机,best focus large objects 模式被采用作为我们的 Z 轴投影计算方法,会有更少的计算需求。对于其他相似的复杂结构,该 2D 投影模式对于透射光拍摄也是推荐的。


针对透射光通道获取的 2D 投影图像随后被导入到 IN Carta 中做后续的分析,该过程可以在拍摄期间或拍摄后进行。被导出的图像大小会自动调整到符合 IN Carta 要求,拼接图像到 2000 x 2000 像素。

 

适用于肠道类器官和隐窝

的深度学习模式生成

无标记成像是不使用荧光标记研究生物过程的一个重要的工具。然而明场获取的图像的自动分析是非常有挑战性的,诸如高背景,阴影效果,背景中的碎片。为了战胜这些因素,我们使用 SINAP,IN Carta 中一个基于深度学习的分割工具。


使用 SINAP,我们开发了两种模型用于分析肠道类器官。训练集是通过使用 SINAP 界面中的笔刷和多边形标记工具标记类器官和背景区域后手动生成的。由于背景和类器官间有很好的对比,14 组带注释的图像足以训练模型,在微调已建立的气道类器官模型的基础上(图 4A )。第二个模型被训练仅用于分割类器官的隐窝/延伸,过程中需要更仔细的注释,23 组训练样本足够训练一个模型,在微调第一个模型的基础上(图 4B )。形状、强度分布和局部环境是允许 SINAP 模型在不包含类器官核心的情况下实现隐窝的强大分割的关键因素。一旦模型得到训练,我们将整个类器官作为主要目标,将隐窝作为细胞器目标之一,以便连接和报告每个类器官内的隐窝(图 4C,图 5A )。

图 3 . 类器官图像的 2D 投影,

(A)Best Focus Large Objects; (B)Best Focus Smaller Objects;(C)Best Plane;(D)Average.

 

图 4 . 标注整个类器官(A)和隐窝(B)用于生成 SINAP 模型。(C)展示了 2 种标记的叠加。在此模型中,我们使用整个类器官作为初级目标,隐窝作为细胞器。

 

使用分类模块分类未成熟,

中间态和成熟类器官

肠道类器官的生长和成熟可以被透射光显微镜监测。通常在培养 3 - 5 天后类器官开始拉长,到第 7 天更加成熟,复杂,多裂的结构(多芽)可以看到。为了量化培养中成熟和未成熟肠道类器官的数量,我们使用了一种机器学习工具 Phenoglyphs,根据它们的表型对类器官进行分类。


使用 Phenoglyphs,用户可以从广泛的检测范围中进行选择,包括对象的形态、相对位置、强度和纹理。为了在 Phenoglyphs 中定义分类规则,通过专用的机器学习算法识别了一组初步的表型簇。接下来,我们选择代表感兴趣的表型的集群:未成熟、中间态和成熟。建议使用较多的集群数量,以减少每个集群内部的异构性。在我们的案例中,我们最初要求 20 个簇,尽管我们预期只有 3 个表型分类。


在检测之前,我们预期与隐窝相关的指标应该对分类贡献最大,因为复杂性意味着更多的隐窝。不出所料,这些指标被列为分类未成熟、中间和成熟类器官的重要指标(图 5B )。然后我们使用前 20 个度量值来训练模型,结果如表 1 所示。可以根据需要更改相关性阈值和 top N。建议选择接近 4*L 的所选度量的数量,其中 L 为类的数量,并将相关性阈值设置为 90,以消除冗余度量,以避免生成对当前数据集过于具体的模型。类器官的代表性图像列于图 5D 中。

 

图 5 . 将整个器官模型设置为初级,将隐窝模型设置为其中一个细胞器(B)。排名得分表示在将对象划分为指定类时,每个参数的重要性。(C)分类器工具中基于单个参数(每个类器官的隐窝个数)。(D)用示例在 Phenoglyphs 向用户展示,以定义类别并纠正错误分类的对象。

 

或者,可以将分类器用作更简单、更直接的分类,它依赖于单个指标,且下限/上限必须由用户手动定义。在本例中,我们选择每个类器官的隐窝数量(organelles org per cell)作为指定类的指标。在图 5C 中,我们将隐窝为 0 的类器官归类为未成熟的类器官,将隐窝为 1 至 6 个的类器官归类为中间类器官,这接近于由 Phenoglyphs 生成的统计数据(表 1 )。对于更复杂的场景,其中两个或两个以上的特征主导分类,Phenoglyphs 是首选的方法。按 well、按 FOV 或按类的汇总结果和单个目标数据可以导出为 .csv 文件,用于进一步的分析。


表 1 .基于分类模块的分类结果

 


  • ImageXpress Pico system 通过导向性工作流程能够实现更快,更便捷的高内涵成像。

  • SINAP 是一个强大的工具帮助用户分割目标,针对传统的图像分析算法难于分析的图像。

  • Phenoglyphs 对于无标记的类器官可实现强大的分类。


关于美谷分子仪器

Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷,并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年,Molecular Devices 在上海设立了中国代表处,2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团,2011 年正式成立商务公司:美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内,我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。



  • 客服电话: 400-6699-117 转 1000
  • 京ICP备07018254号
  • 电信与信息服务业务经营许可证:京ICP证110310号
  • 京公网安备1101085018
  • 客服电话: 400-6699-117 转 1000
  • 京ICP备07018254号
  • 电信与信息服务业务经营许可证:京ICP证110310号
  • 京公网安备1101085018

Copyright ©2007-2024 ANTPEDIA, All Rights Reserved