顶刊药筛的选择？发 Cell 和新冠药筛都需要用到它

2022-11-11 18:02:17, Tina&张简美谷分子仪器（上海）有限公司

药物筛选无论在医学研究领域或是药物开发领域都是十分重要的环节，在这个过程中筛选得到靶向特定靶点的高生理活性的化合物无疑是至关重要的。

现如今繁多的化合物种类和日渐增加的新靶点，都指向了高通量药物筛选的必要性，而无论是使用较为传统的 ELISA，还是通过 FRET、HTRF 等方法，都可以通过高通量药物筛选平台 SpectraMax Paradigm 进行检测，一次性完成 6、24、96、384 乃至 1536 / 3456 孔板的检测，极大地提高了实验效率和准确性，能够更好地满足实际实验中药物筛选需要。无论是发表在 Cell 上，筛选靶向 TLS 抗肿瘤药物的研究，还是在新冠大流行背景下，对靶向新型冠状病毒主蛋白酶的抗病毒药物的筛选，或者是在常规实验中检测细胞内 H₂O₂ 水平的需求，都可以通过 SpectraMax Paradigm 这一台仪器完成，下文将具体就相关实验的设计、结果与具体实验流程展开介绍。

Cell 66.850

1. A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy

在肿瘤治疗领域当中，传统的通过损伤 DNA 的方式杀伤肿瘤细胞的化学疗法一直具有无法取代的地位。而在这种治疗之下，细胞可以通过跨损伤合成（TLS）这个过程利用专门化的 DNA 聚合酶从而绕开 DNA 损伤的区域，以牺牲 DNA 保真度为代价促进细胞存活。而此篇文章的重大意义在于通过筛选找到了这样一种可以靶向 TLS 过程的小分子抑制剂 JH-RE-06，可以阻止诱变 POLζ 的募集来破坏诱变 TLS，并且通过后续实验验证得到顺铂、JH-RE-06 可双药联合相较于顺铂的单药化疗来说对小鼠的耐药肿瘤模型上显示出更显著的肿瘤抑制作用，并且可以降低由于化疗所引起的继发性肿瘤的可能性，从而降低传统化学治疗的副作用。

Graphical Abstract

Figure 1 阻断 REV1 CTD-REV7 相互作用的

小分子抑制剂 JH-RE-06 的发现与其特征

在化合物的筛选步骤中应用到了 ELISA 实验。在 ELISA 实验（Figure 1A）中，将纯化后共表达 REV3 肽链的 His₈-REV7 固定在 Ni²⁺-NTA 包被的孔中，并通过辣根过氧化物酶（HRP）耦联的抗 FLAG 抗体检测其在小分子抑制剂存在情况下结合 FLAG 标记的 cREV1 CTD 的能力。作者选择 TMB 作为底物，反应结束后通过使用高通量药物筛选平台 SpectraMax Paradigm 检测 450nm 处的吸光度来寻找可以和 REV1 CTD-REV7 相互作用的小分子。

在这个过程中，作者从 LOPAC 文库和 PRESTWICK 文库中筛选了 1 万个结构不同的化合物，也在 KCB （Korea Chemical Bank）化合物库中筛选了具有代表性的化合物。最终鉴定得到 JH-RE-06，可以 10mM 浓度下有效地抑制 REV1-REV7 相互作用，作为后续的研究对象^[1]。

FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光共振能量转移）基于非辐射的能量跃迁。将一个蛋白上耦联供体（donor），另一个蛋白上耦联受体（acceptor），以下图为例即供体为 CFP，受体为 YFP。当两个蛋白间距离较远时，CFP 可以在 433nm 波长的荧光激发下发射 475nm 波长的荧光，而 YFP 不被激发；只有当供体和受体靠近时，即两个蛋白之间存在相互作用时，可以发生 FRET，使得 YFP 被激发，产生波长为 530nm 的荧光。可以应用于细胞内分子间相互作用、细胞膜受体蛋白之间相互作用等研究。而使用高通量药物筛选平台 SpectraMax Paradigm 的 FI 卡盒（Fluorescence Intensity）可以同时完成对双荧光信号的检测，检测速度更快且结果更准确，不受光源强度、电压等变化的影响。

FRET 原理

（Yamao，Masataka et al. PloS one. 25 Oct. 2016）

Nature communications 17.694

2. Both Boceprevir and GC376 efﬁcaciously inhibit SARS-CoV-2 by targeting its main protease

中国科学院微生物研究所齐建勋课题组在 Nature Communications 上发表的研究证实丙肝药物博赛泼维（Boceprevir）和 GC376（临床前期药物，针对猫传染性腹膜炎病毒的抑制剂）可以通过靶向新型冠状病毒的主蛋白酶（main protease，M^pro）起到病毒抑制作用。

Table 1. 18 种待筛抗蛋白酶化合物

新冠病毒的主蛋白酶在病毒多聚蛋白的加工和成熟过程中起到重要作用，也因此是研发治疗新冠病毒药物的重要靶点。首先，作者发现了新冠病毒 M^pro 与其他冠状病毒 M^pro 之间的同源性，因此选择了靶向不同病毒蛋白酶和蛋白酶体的 18 种化合物进行进一步筛选（Table 1）。

Figure 1. 高通量药物筛选

进一步作者通过在单一浓度下，在体外进行 FRET 实验对这些化合物进行筛选（Figure 1 a，b）。最终发现有两种抑制剂，即 Boceprevir 和 GC376，可以很好地抑制酶活性。RFU 值（relative ﬂuorescence units）是在 37 度的条件下，激发波长为 360nm，发射波长为 490nm，使用高通量药物筛选平台 SpectraMax Paradigm 检测 1 小时得到^[2]。

Biochem Biophys Rep. 3.322

3. Involvement of NADPH oxidase 1 in UVB-induced cell signaling and cytotoxicity in human keratinocytes

Glady，Azela 等人在这篇文章中试图探究 UVB- 诱导的活性氧的来源和作用，最终得出结论：Nox-1 介导的 ROS 的产生，是 UBV 通过 p38 激活和炎性细胞因子生成所导致的细胞毒性和炎症所必须的，所以，作者认为 Nox-1 可以作为 UVB 接触后所产生的细胞毒性和炎症的一个可能的治疗靶点。

在实验的过程中作者需要对细胞内的 H₂O₂ 水平进行检测，主要通过向细胞内转染 H₂O₂敏感性探针 pHyPer cDNA 质粒，在完成稳转株的构建后通过使用高通量药物筛选平台 SpectraMax Paradigm 对细胞荧光进行检测，YFP 与 CFP 激发波长的比值用来衡量细胞内 H₂O₂的水平^[3]。

Figure 1G

作者通过对 Nox1 的敲除发现可以抑制 UVB 诱导的即时或迟发的细胞内 H₂O₂ 水平的升高，可以看出 Nox1-siRNA 组在 UVB 处理 0.5h、3h 和 10h 时， YFPex/CFPex 的比值显著低于对照组（Figure 1G）。

高通量药物

筛选平台

SpectraMax

Paradigm

高通量药物筛选平台 SpectraMax Paradigm 可以进行光吸收、荧光、时间分辨荧光（包括 HTRF）、荧光偏振、AlphaScreen、AlphaLISA 以及化学发光的检测。检测卡盒式的模块化设计，不仅可以满足目前检测的需求，还可以根据未来应用需求灵活的进行升级，通过插入新功能检测卡盒，仅需要短短几分钟完成对读板机的升级，是您药物筛选的得力助手。

参考文献：

[1] WOJTASZEK J L, CHATTERJEE N, NAJEEB J, et al. A Small Molecule Targeting Mutagenic Translesion Synthesis Improves Chemotherapy [J]. Cell, 2019, 178(1): 152-9.e11.

[2] FU L, YE F, FENG Y, et al. Both Boceprevir and GC376 efficaciously inhibit SARS-CoV-2 by targeting its main protease [J]. Nat Commun, 2020, 11(1): 4417.

[3] GLADY A, TANAKA M, MONIAGA C S, et al. Involvement of NADPH oxidase 1 in UVB-induced cell signaling and cytotoxicity in human keratinocytes [J]. Biochem Biophys Rep, 2018, 14: 7-15.

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