文献导读 | 基于质谱的蛋白质糖基化鉴定、表征和生物功能阐述

2022-11-08 18:07:52, 西湖欧米西湖欧米（杭州）生物科技有限公司

编者按：

近期，Frontiers in Chemistry编辑整理了国内外糖蛋白组学领域的20篇专家论文。西湖欧米针对该合集做了针对性的导读。

糖基化

糖基化是最常见和复杂的翻译后修饰类型，其修饰类型包括：N-连接糖基化，O-连接糖基化，C-连接糖基化和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚。蛋白质糖基化的改变与某些疾病密切相关如癌症，神经退行性疾病等，据报道超过 50% 的人类蛋白质被糖基化。到目前为止，Uniprot 中预测的糖蛋白中只有不到 20% 得到了实验验证。因此，迫切需要一种全面、快速和灵敏的方法来验证蛋白质糖基化。

N-糖基化蛋白综合分析方法包括: 一、热反应磁性流体固定酶的 N-糖蛋白质组超快样品制备，其蛋白质消化和糖肽的去糖基化可在 3 分钟内完成（Fan等, 2021）。该方法成功应用在大规模尿液样品蛋白质 N-糖基化的分析中，具备了分析临床样本N-糖蛋白质组的潜力。二、Chen Cheng等人开发的TiO2同时富集糖肽和磷酸肽的方法，经顺序洗脱后可以将去糖基化肽和磷酸肽分离，结合 MS分析可以分别表征糖基化和磷酸化位点。

N-连接糖基化概述图

完整的糖肽分析可以提供关于糖基化位点和聚糖组成等信息，使我们进一步了解蛋白质组范围内的聚糖异质性。Tabang 等人全面回顾了基于 MS 技术的进展，重点表征了糖尿病、胰腺炎和胰腺癌的糖组和糖蛋白组。预计基于 MS 的方法将发现用于早期检测人类疾病的新蛋白标志物。Zhao等人综合多组学分析表明，2 型糖尿病 (T2D) 患者补体激活通路相关蛋白的N-连接糖基化位点特异性改变，此特征可以用于早期T2D检测的潜在临床蛋白靶标。证明了基于 MS 的糖蛋白组学方法是理解（前）糖尿病的有力工具。Demus 等人的研究表明，载脂蛋白-CIII（apo-CIII）糖基化可能调节甘油三酯的清除，这有助于我们了解 apo-CIII 在各种疾病环境中调节脂质代谢中的作用。Lang等人比较研究发现，2-AA 标记结合多孔石墨碳色谱-质谱（PGC-MS）技术能够在一个简单的方案中全面表征复杂的人乳寡糖混合物的特征。Shu Hong 等人应用凝集素印迹和完整 O-连接糖肽 MS 分析，在触珠蛋白（Hp）上共鉴定出26个完整的O-糖肽并发现 HCC 患者血清中大多数 O-糖肽的上调。揭示了Hp的 O-糖基化异常与肝脏疾病相关，糖基化可以作为诊断，预后的标记物和治疗靶标。

O-连接糖基化概述图

聚糖被认为是癌症的潜在生物标志物。液体活检，例如血液和尿液，是筛选和表征早期检测人类疾病的靶标的重要来源。 此外，通过基质辅助激光解吸/电离实现的聚糖成像 MS 已被用于辅助组织学和免疫组织化学以监测胰腺疾病的进展，可在空间上映射新鲜冷冻或福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织切片中的生物分子（Briggs, et al., 2019）。Blaschke等人开发了一种适合N-聚糖的分析方法。使用 MALDI-MS 并结合 MSI分析了前列腺组织的 N-聚糖谱，发现存在于液体中的 N-聚糖来自腺腔。该方法能够分析大型临床队列和其他生物液体。Shu Jian等人展示了凝集素Microarray和 MS 分析食管鳞状细胞癌 (ESCC) 患者的唾液蛋白质糖基化，与健康对照相比，ESCC 患者的特定糖模式（例如唾液酸化和岩藻糖基化）发生了显著变化。DSA (曼陀罗) 检测被认为是一种潜在的ESCC诊断工具。

COVID-19 的病原体 SARS-CoV-2 的S基因编码具有 22 个潜在 N-糖蛋白位点和数十种潜在的 O-连接糖位点，它们可能在蛋白质折叠和免疫逃避中起关键作用。Wang Qiong等人比较了中国仓鼠卵巢（CHO）和人胚胎肾（HEK）细胞表达重组 S 蛋白的 N-糖基化谱，揭示了 CHO细胞表达更复杂和更多唾液酸化S 蛋白，而HEK 细胞表达更多的高甘露糖和少量的唾液酸化S 蛋白。Zhang Yong等人使用基于高能碰撞诱导解离（HCD）和电子转移HCD（ETHcd）MS 的方法比较了昆虫和 HEK 细胞产生的重组 S 蛋白的 O-糖基化谱，发现来自人类细胞的 S 蛋白中的大多数 O-糖苷酸是唾液酸化的，O-糖基化位点和O-聚糖组成随宿主细胞类型而变化。Cui等人开发了一种双功能组氨酸键合二氧化硅的 O-糖肽富集方法，用于HKU1 S蛋白分析，鉴定到了46 个 O-糖基化位点。这些发现将促进对HKU1 S 蛋白微观结构的洞察和潜在的疫苗研发。

MS是一个强大分析聚糖结构的工具，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）已成为当下糖蛋白（同时获得糖链，肽段，糖基化位点信息）研究的主流方法。Zhang Rui等人开发了一种基于葡萄糖单位指数（GUI）的自动化工具 (GlycanGUI)，能根据峰强度对相应离子进行量化。GlycanGUI 可以解释不同色谱柱、MS 仪器和/或缓冲液，甚至不同的实验室产生的数据。Huang等人开发了一种用于处理基于 MALDI-MS 的聚糖同位素标记数据 (gQuant) 的自动化工具，它采用一组专用算法设计，包括光谱预处理、聚糖映射、定量和比率计算，以提高定量数据处理的效率、准确性和便利性，促进了临床样品的快速糖组定量分析。Wang Hui等人开发了一种能消除噪声同位素峰簇和光谱偏移对分析结果干扰的新算法 (hepPareser)，可以根据 LC/MS 数据快速，准确的对低分子量肝素（LMWH）的主要成分进行自动分析。这将促进LMWH糖基化的结构和功能研究。

O-连接N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖（O-GlcNAcylation）是对丝氨酸和/或苏氨酸残基的羟基进行翻译后修饰的一种普遍形式（Torres等，1984），与许多疾病相关。对 O-GlcNAcylation 进行系统表征，可以揭示其在人类疾病中的功能和作用。Zhu 和 Yi 综述了用于表征 O-GlcNAcylation 的化学辅助方法，为 O-GlcNAcylation 的标记和鉴定提供了全面的见解。Yin等人系统回顾了基于 MS 的 O-GlcNAcylation 定性或定量表征方法，如亲和富集、代谢标记或化学标记与MS 的结合，都加深了对生物体中 O-GlcNAcylation 的结构和功能机制的理解。

糖基化蛋白的糖链被细胞表面识别蛋白识别并与之结合，进而发挥其功能，因此，糖修饰是其发挥生物功能不可或缺的一环。通过基因编辑可以改变糖基化的模式。Yang等人应用完整糖肽分析方法揭示了正常 CHO 细胞和敲除 Fut8 的 CHO 细胞之间核心岩藻糖基化的差异表达。敲除FUT8 不仅影响蛋白糖基化模式，而且能改变一些蛋白的相对丰度。利用此特征，将聚糖组成、结构和修饰蛋白质的关系可以绘图（Narimatsu 等人，2019 年；Huang 等人2021）。

总之，蛋白质糖基化修饰的精准分析对于疾病机制研究、生物标志物发现，以及药物和疫苗开发至关重要。本综述收录的论文将有利于识别、表征和阐述蛋白质糖基化功能，并为糖肽的完整分析提供有用的信息。

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撰文：陈善军

图片：来源于网络

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