mRNA药物的研发和关键质控要点概览

自mRNA新冠疫苗问世以来，已经有超过100个国家和地区超过五亿剂的接种，创造了制药及疫苗史上的双记录。mRNA疫苗被全球知名科技媒体《麻省理工科技评论》评为“2021年全球十大突破性技术”，并荣登榜首。其重大意义在于：mRNA技术可能带来医药领域的巨大变革。

mRNA疫苗（药物）是将含有编码抗原蛋白的mRNA导入人体，跳过复制、转录过程，直接进行翻译来形成相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性免疫应答，达到预防或治疗的目的。在mRNA疫苗（药物）发挥作用的过程中，构建特异性抗原的mRNA序列、mRNA胞内递送策略、激活强大的免疫系统是三大重要环节。

mRNA的序列模拟内源性mRNA的结构，有五个部分，分别是：5ʹcap，5ʹ非翻译区（ UTR ），编码抗原的开放阅读框，3ʹUTR和Poly A尾。5′端结构会在空间上保护mRNA不被核酸外切酶降解，Poly  A尾的长度间接调节mRNA翻译和半衰期。5′和3′UTR调节mRNA翻译、半衰期和亚细胞定位，其中开放阅读框可以通过优化密码子，在不改变蛋白质序列的情况下增加翻译。所以在前期研发阶段，需要构建大量酶反应体系以进行密码子的优化工作。

贝克曼库尔特的自动化工作站搭配RNAclean XP产物纯化试剂实现高通量、自动化的反转录体系构建、反应产物纯化，以快速获取优质序列的mRNA产物。

RNAclean XP产物纯化试剂通过专利的SPRI 可逆固相（专利号：US5705628，US5898071，US6534262）结合磁珠技术试剂盒，从常见的酶反应中纯化 RNA，可以完全去除盐、未合并的寡核苷酸等，获得高质量的纯化产物。

SPRI三层磁珠结构       

RNAclean XP纯化峰图

而重复的系列IVT反应，加帽加尾反应体系构建可以由自动化工作站来实现，不但可以获得稳定的重复结果，工作站上配置的HEPA也可避免气溶胶污染。

Biomek i5自动化工作站       

凝胶电泳验证结果无交叉污染

在mRNA的工艺中一般先将编码目的抗原的基因序列构建入质粒中，通过质粒线性化，反转录获得mRNA，在转录中或转录后进行mRNA的加帽、加尾以及碱基修饰。修饰完成后获得的mRNA产物会产生截短型RNA、双链(ds)RNA、序列错误的反应物等杂质，需要用合适的方法进行检测，主要的检测项目有：

SCIEX 的毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统采用激光诱导荧光检测器配合不同的核酸检测试剂盒，可完成mRNA的完整性、加帽率及Poly A 尾分布分析。

PA 800 Plus 制药分析系统     

mRNA Ladder完整性检测

mRNA 加帽率检测      

mRNA poly A尾检测

而采用SCIEX的X500B或者Zeno TOFTM 7600高分辨质谱系统进行检测，根据精确分子量，不但能区分加帽和不加帽的部分，还能鉴别不同的Cap种类。同时质谱还能进行Poly A的长度分布表征及相对定量。由于核酸表征分析需要加入离子对试剂，这对质谱的抗污染能力提出了很高的要求。

ZenoTOF TM 7600  

高分辨质谱系统

X500B

mRNA加帽鉴定

mRNA Poly A 尾分布分析

将mRNA胞内递送到正确的细胞并诱导免疫激活是具有挑战性的，裸露的mRNA很容易被细胞外RNA酶降解，哪怕进入细胞也容易在溶酶体聚集，抵达不了发挥作用的地方。目前，已经开发了多种递送载体如鱼精蛋白、脂质体、树突细胞、无机纳米粒子等用于促进mRNA疫苗（药物）的细胞摄取并保护其免于降解。由于目前获批的mRNA疫苗都是采用脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNPs)，因此LNP是目前mRNA疫苗最常用的载体之一。LNP主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂（PEG-脂质）组成，通过微流控与mRNA混合，形成mRNA-LNP复合物。

LNP的几种成分比例将决定mRNA-LNP复合物的颗粒大小、mRNA与LNP结合的稳定性、内吞及逃逸等情况，因此在研发过程中，需要花费大量的时间精力来进行LNP比例的优化，采用贝克曼库尔特的自动化工作站亦可高效完成这种繁复的实验。

另外，也需要采用多种手段对mRNA-LNP进行多方位的表征。

形态学观察是进行物质结构研究最直接和客观的证据，采用冷冻透射电镜进行载药脂质体的观察，能够清晰、准确地查看分布形态、颗粒大小和颗粒完整度等情况，徕卡的电镜载网喷镀连续碳膜和辉光放电处理的EM ACE600和投入冷冻仪EM GP2，可以便捷地完成高质量的载药脂质体的冷冻前处理。

载药脂质体的冷冻电镜图

（ 电子显微学报2012 ）

EM GP2

全自动快速投入冷冻仪

另外，通过荧光标记药物，共聚焦显微镜能够观察包裹在脂质体内的药物进入细胞的过程， STELLARIS STED 纳米光学成像系统能对纳米级别的物质结构进行精细观察，用以判断进入细胞内的活性分子的比例。

STELLARIS STED 纳米光学成像系统

LNP包裹的siRNA进入细胞

siRNA/LNP复合体从溶酶体逃逸

（J. Mater. Chem. B, 2021,9, 5136-5149）

在载药脂质体的包封率检测方面，除了采用常规的免疫荧光法外，还可以采用密度梯度离心法。由于LNP颗粒和mRNA的浮力密度不同，LNP 浮力密度通常小于1（若N/P为6，其浮力密度约为0.96），而mRNA浮力密度约为1.8 ，可以基于LNP颗粒和mRNA密度的不同将其分开，然后再分别进行检测。贝克曼库尔特拥有一系列低速、高速和超速离心机，可对不同状态的mRNA-LNP复合物进行离心分离检测。

台式多功能离心机

高速冷冻离心机

落地超速离心机

此外，贝克曼库尔特的分析型超速离心机Optima AUC遵循第一性原理 (基于数学、物理)，不需要标准品，非破坏性，可根据载药颗粒及游离药物的沉降系数不同对包封率进行准确分析（小分子药物、siRNA、miRNA等），也可用于检测游离聚合物的含量。AUC可区分空的（empty）及包裹的（full）纳米颗粒，表征纳米颗粒的纯度等。也可对纳米颗粒粒径及分子量进行准确分析，以及对纳米载药颗粒的储存条件（时间、温度）、降解原理等进行分析。除此之外，AUC 还能用于mRNA原液的检测，基于mRNA沉降系数，检测不同长度及状态的RNA，有效区分截短 mRNA、目标mRNA及mRNA聚集体等不同组分。

Optima AUC分析型

超速离心机   

mRNA检测的原始结果

不同峰的分析结果

在评估LNP不同的生产工艺或批与批之间载体的一致性，还可根据其等电点范围进行质量控制。SCIEX 的PA 800 Plus制药分析系统通过等电聚焦电泳的模式对LNP进行等电点检测，分辨率可达到0.03 pI。

PA 800 Plus制药分析系统对LNP等电点进行检测

mRNA技术如今已经广泛用于肿瘤、传染性疾病、罕见遗传病等的药物开发，丹纳赫生命科学从研发到质控的一些列方案，可以帮助用户加快药物开发进展。

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