从初筛到验证！酪氨酸磷酸化修饰组学研究“快车道”

蛋白质的酪氨酸磷酸化 (Tyrosine phosphorylation, pY) 对细胞信号转导起着重要的作用，其异常调节对癌症、脑部疾病、感染性疾病的发生发展密切相关[1]。因此多家知名药企开发了针对受体酪氨酸激酶的小分子抑制剂，成功投入临床应用，为疾病治疗提供了巨大帮助。如现象级电影《我不是药神》中的格列卫 (伊马替尼)就是通过抑制BCR-ABL酪氨酸激酶，使其下游底物蛋白不能发生磷酸化，从而抑制肿瘤细胞的增殖和诱导其凋亡[2,3]。

图1 酪氨酸激酶是重要的治疗靶点

pY修饰只占到所有蛋白磷酸化修饰的1-2%，运用IMAC富集的磷酸化修饰组学技术鉴定到的pY位点数量极少。景杰生物PTMab抗体平台独立开发的酪氨酸磷酸化修饰泛抗体 (PTM-702RM/树脂PTM -703)，能够特异性富集样本中的酪氨酸磷酸化肽段，显著提高pY鉴定水平，极大的拓展对酪氨酸磷酸化修饰的认识。对小鼠脑组织样本的实测显示IMAC富集方法共鉴定到pY位点258个，pY泛抗体富集鉴定到1441个pY位点，鉴定深度为前者的5.58倍。

图3 抗体特异性富集pY显著提升鉴定深度

pY泛抗体富集方法能够帮助发现之前未鉴定到的酪氨酸磷酸化靶标分子，并揭示新的生物学功能。亚细胞定位分析显示IMAC富集的常规磷酸化修饰蛋白绝大部分在细胞核里，而pY泛抗体富集可鉴定到细胞质、细胞核和细胞膜中的许多pY修饰位点，且GO分析进一步揭示了pY修饰在化学突触传递调节、跨突触信号调节、细胞突起形态发生等方面新的生物学功能。

图4 抗体富集pY位点与IMAC富集常规磷酸化位点的亚细胞定位和生物学过程比较

结合全新一代4D蛋白质组学技术和技术升级，pY修饰组学鉴定深度进一步提升。对4种组织 (小鼠脑、小鼠心、人胆管癌组织和人胃癌组织) 和3种细胞 (HeLa、过钒酸钠处理的HeLa、人结直肠癌细胞) 开展pY修饰组学分析，在严格的数据标准下，在小鼠脑组织中鉴定到1441个pY位点，过钒酸钠处理后的HeLa细胞中鉴定到1521个pY位点(FDR <0.01；Score得分≥40；位点 Localization probability≥0.75)

图5 pY修饰组学鉴定到的pY位点数目

pY修饰组学技术表现出卓越的数据重复性和稳定性。生物学重复测试结果表明绝大部分pY位点在两个样本中都能被检测。相关性分析显示两个样本间的相关性系数pearson可达0.95。高度可信的数据，有助于我们挖掘出关键的修饰蛋白进行后续的验证和功能研究，为大规模样本 (如癌症临床大队列样本、多浓度多药物多样本等) 的酪氨酸磷酸化研究提供坚实的保障。

图6 生物学重复测试结果

此外，景杰生物原创的pY泛抗体 (PTM-702RM) 也为pY修饰组学研究上了一道“安全锁”。普通的IMAC磷酸化修饰组学需将样本进行质谱检测后，才能知晓样本间磷酸化修饰的趋势和差异情况。通过pY泛抗体的WB初筛选，可提前知晓样本中pY修饰的变化程度与趋势，指导后续的pY修饰组学分析，从而提高科研效率。如下图所示，不同样本的pY泛抗体WB初筛预实验，可明显发现在这些样本中广泛存在着pY修饰，另外不同处理的嗜热毁丝霉的pY修饰水平也发生显著的差异变化，可开展进一步的pY修饰组学定量研究。

图7 不同样本酪氨酸磷酸化修饰的WB初筛结果

而在组学研究之后，对于研究发现的关键的pY修饰位点，景杰生物先进的PTMab®抗体开发中心，可提供pY位点定制抗体开发服务[9]，为功能挖掘与验证提供强有力支持。PTMab®抗体开发中心，已经成功定制各种新型翻译后修饰抗体类型超过20余种，如乳酸化、巴豆酰化修饰等抗体，超过400个翻译后修饰抗体的定制开发。PTMab®抗体定制提供灵活的定制服务方案，全方位满足客户需求。

图8 CAKTM1 p-Y153 抗体定制 (应用于WB实验)

Tips

最后给大家分享一个小福利，可预测pY修饰位点的几个在线工具网站，这些网站都能实现对pY修饰位点的预测。如果在所研究的蛋白上，预测到修饰位点，大家可以挑选合适的样本去富集靶标蛋白，然后通过pY修饰组学去鉴定该蛋白上发生pY修饰的位点。

①预测pY修饰位点网站：http://tsp.biocuckoo.org/；

②真核蛋白中磷酸化位点神经网络预测网站：https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1；

③专注于对人类、酵母、蠕虫和蝇类的蛋白激酶分析预测网站：http://www.kinase.com/ kinase.com；

④能够预测蛋白质初级结构、结构域、理化性质和翻译后修饰位点的网站：https://prosite.expasy.org/scanprosite/

参考文献

1. Sofi G. Julien, et al. 2011, Inside the human cancer tyrosine phosphatome. Nat Rev Cancer.

2. Hochhaus A, et al. 2011, Impact of BCR-ABL mutations on patients with chronic myeloid leukemia. Cell Cycle.

3. Cohen P et al. 2021, Kinase drug discovery 20 years after imatinib: progress and future directions. Nat Rev Drug Discov.

4. Lundby A, et al. 2019, Oncogenic Mutations Rewire Signaling Pathways by Switching Protein Recruitment to Phosphotyrosine Sites. Cell.

5. Zhang Q, et al. 2019, ALK phosphorylates SMAD4 on tyrosine to disable TGF-β tumour suppressor functions. Nat Cell Biol.

6. Dittmann A ,et al. 2019, High-fat diet in a mouse insulin-resistant model induces widespread rewiring of the phosphotyrosine signaling network. Mol Syst Biol.

7. Liu S, et al. 2017, Lck/Hck/Fgr-Mediated Tyrosine Phosphorylation Negatively Regulates TBK1 to Restrain Innate Antiviral Responses. Cell Host Microbe.

8. Shi X ,et al. 2021, Disrupting phosphorylation of Tyr-1070 at GluN2B selectively produces resilience to depression-like behaviors. Cell Rep.

9. Kurmi K, et al, 2018, Tyrosine Phosphorylation of Mitochondrial Creatine Kinase 1 Enhances a Druggable Tumor Energy Shuttle Pathway. Cell Metab.