染色质生化研究进入条码测序时代

带“条形码”的半合成核小体（nucleosome）搭配大规模平行测序技术（massivelyparallel sequencing），能够为我们提供一个全新的技术平台，用来分析染色质相关蛋白质（chromatin-associatedproteins）的组蛋白识别（histone-recognition）及组蛋白修饰（histone-modifying）活性。

我们过去一直认为组蛋白的功能非常简单，只是在DNA的核内包装过程中起到一个骨架的作用。但是现在我们已经逐渐认识到了组蛋白，以及组蛋白的各种翻译后修饰作用（post-translationalmodifications, PTM）在DNA可接近性（DNAaccessibility），以及基因组功能方面所具备的重要的动态调控功能。在众多作用机制当中，组蛋白的PTM可以通过招募各种效应蛋白（effector protein）来发挥调控作用，这些效应蛋白能够解析在染色质上的各种组蛋白PTM状态。经过近20年的科学研究，我们对这些PTM是如何产生、删除，以及如何被解读的机制的认识有了比较大的提升，但我们还是不太清楚这些PTM在核小体这种染色质基本结构单元中发挥的生化作用是如何被调控的。不过最近在这方面取得了突破，Nguyen等人将天然化学连接重组核小体技术（native chemical ligation coupled withrecombinant nucleosome technology）与高通量测序技术（high-throughputsequencing）这两种在染色质生化研究工作中比较成熟的技术结合起来，开发出了一种功能强大，适用范围有非常广的新方法，利用各种打好条形码的核小体文库，就可以确定这些功能复杂的染色质条款因子了。

在发现组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases）和组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases）具备转录调控功能之后，科学家们又紧接着利用各种经过修饰的组蛋白多肽（modified histonepeptides）开展了一系列对今后具有重大影响作用的结构研究和生化研究，发现bromodomain结构域就是一种能够识别乙酰基—赖氨酸（acetyl-lysine）结构的基序，在这个确凿证据的支持下，从而将组蛋白PTM与基因活性给联系了起来。后来由于利用了固定组蛋白多肽（immobilizedhistone peptides）或各种已标记识别结构域（tagged putative reader domains）的高通量芯片筛查技术（high-throughput, microarray-based screening）有了进一步的发展，我们在发现PTM识别结构，以及PTM靶标结构等方面又取得了不错的成果，发现了好些染色之效应子结构域，比如恶性脑肿瘤结构域（malignant braintumor domain）、Tudor结构域和植物同源结构域（planthomeodomain）等。

虽然已经取得了这些不错的成绩，了解了一些效应蛋白与染色质的相互作用机制，但这主要反映的都是一个结构域与几种修饰后的组蛋白多肽之间的相互作用。可是很多效应蛋白里都含有好几个识别结构域，每一个核小体也都含有两对核心组蛋白（即H2A、H2B、H3及H4组蛋白），有些核小体里还含有H2A.Z、H2A.X和H3.3等其他组蛋白，这些组蛋白在染色质里都有各自独特的作用，我们对此还是知之甚少。核小体和效应蛋白的这种组织结构创造出了非常复杂的染色质识别体系。比如，一个含有多个结合结构域的染色质效应蛋白就应该能够特异性地识别一个组蛋白上的多个不同的PTM，或者位于一个核小体、或者相邻核小体上的多个不同组蛋白上的PTM。实际上，最近开展的一项研究使用半合成核小体也证实了，NURF染色质重构复合体中的BPTF亚基就能够依靠其自身的bromodomain结构域和植物同源结构域，通过反式相互作用（trans interactions）分别识别H4K16ac和H3K4me3这两种组蛋白PTM。这种依靠核小体的实验技术也让我们能够在更加符合生理状态的条件下，研究染色质效应蛋白与各种PTM之间的关系，但低通量是这种方法的缺陷，一次只能研究一个核小体因子。所以严重阻碍了染色质核小体研究工作的进展。

图1 带有各种已修饰组蛋白的DNL可以被用来验证组蛋白PTM抗体的特异性，研究带有单个或多个识别结构域的核小体间的相互作用，以及验证酶的组蛋白修饰活性。其基本作用原理都是对各种实验富集的核小体上的DNA条形码进行大规模平行测序。

Nguyen等人采用的则是一种现有技术的改进版，他们利用表达蛋白连接技术（expressed-protein ligation technology）快速地生成了规模庞大的半合成核小体文库，这些半合成核小体的一个或者多个组蛋白上全都带有一个或者多个非常明确的、已知的PTM。他们的创新之处就在于使用了带有独特条形码标签的DNA来合成人工核小体。由这些核小体组成的DNA标记核小体文库（DNA-barcoded nucleosome libraries, DNL）会被用于具有与染色质免疫沉淀（in vitro chromatin immunoprecipitation）体外实验同样灵敏度的竞争性生化反应（competitive in-solution biochemicalassay），然后对实验所得再进行高通量测序，即用于所谓的ChIP-seq实验（图1）。除了高通量确定组蛋白识别结构域和修饰因子的PTM特异性这一个作用之外，DNL文库技术还能够对PTM特异性抗体进行验证。实际上，抗体的特异性是染色质研究领域非常关注的一个问题，尤其在要求高精确性全基因组组蛋白PTM分析这个工作方面更是如此。

Nguyen等人使用这个技术平台对BPTF和BRD4这两种已经被研究得非常清楚的组蛋白识别结构域，以及p300这种组蛋白乙酰转移酶进行了验证性实验。除了发现了这些因子之间的已知的相互作用之外，他们还发现组蛋白H4的多聚乙酰化作用（polyacetylation）在招募这些因子时也起到了非常重要的作用。尤其值得一提的是，p300与多聚乙酰化的H4蛋白之间的结合进一步促进了p300对组蛋白的乙酰化修饰作用，即起到了一个正反馈的作用。Nguyen等人还发现，在H3K4me3核小体中也存在这样一个正反馈通路，这也就更进一步明确了反式组蛋白相互作用对p300这样的染色质调控因子也产生了影响。

在染色质研究工作中，建立DNL文库是一项重大的进步，很有可能会在不久的未来带来突破性的进展。虽然Nguyen等人的工作已经非常清楚地证实了该技术的强大优势，但是半合成核小体构建工作还是存在一些技术上的难点，需要对有机化学实验技术和生物化学实验技术相当熟练的人才能够胜任。所以这项技术是否能够得到广泛推广，我们还需要拭目以待。除此之外，这种半定量式的方法可能也不太适合解析复杂的相互作用，比如PTM不对称识别（比如同一个核小体内的H3二聚体分别进行了不同的PTM修饰）或者携带有不同PTM的两个相邻核小体间的反式相互作用（transinter-nucleosomal interactions）等。不过随着DNL技术的不断推广和应用，这些问题在未来肯定会得到妥善的解决。无论如何，这种新技术在解析复杂的染色质调控因子招募和作用这个领域一定会做出更大的成绩。

文章转载自生物360