【知识分享】干货!液相色谱柱活化方法、维护与注意事项(上)

2022-08-19 19:25:29



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液相色谱柱通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱,或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质,在其表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)称为C18柱,其它常用的反相柱还有C8、C4、C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱、GPC柱、聚合物填料柱等。

介绍

Highlights

液相色谱柱的活化方法、维护与注意事项

色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温、测试系统(仪器的死体积)等条件的差异而有所不同。

所以在实验室最好建立自己的色谱柱台账,对每根色谱柱进行编号入库、并追踪其使用过程,实现全生命周期化管理。每个时间节点记录其柱压、峰型、进样针数等信息。

一.

液相色谱柱的活化方法

新买的液相色谱柱需要活化,活化的方法因柱子而异,普通反相C18柱的话我是这样活化的:0.5 ml/min流速的甲醇冲洗2小时以上。液相的新色谱柱都是保存在一定的保存液中的,所谓的活化就是替换掉其中的保存液,冲洗掉柱中可能残留的其他杂质,以免影响后续分析工作。

不同的色谱柱活化的方法不尽相同,要根据柱子的种类来选择活化方法。另外,要提醒的是,柱子活化时不要接检测器,避免不必要的污染。

其它问答,新买气相色谱柱活化时间多久合适?

急用的话,一两个小时足矣。一般都是晚上活化,不占用白天时间,一个晚上从低温到高温,再回到低温,很慢地改变温度走一遍就可以了。

液相色谱柱活化到底起到一个什么样的作用?

1.排除有机相挥发所产生的起泡。

2.柱子一般是键合了C18的,用甲醇冲柱子就是使得这些基团达到更好的排列,有利于我们做样。

二.

液相色谱柱的维护

01

色谱柱的平衡

反相色谱柱由工厂测试后是保存在甲醇或乙腈水溶液中的。新柱应先使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和甲醇或乙腈水溶液互溶。每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得最大的"补偿",而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!

操作步骤如下:

a.平衡开始时将流速缓慢地提高,用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂流速如果较低,则需要较长的时间来平衡);

b.如果使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用10—20%甲醇水“过渡”即每天分析开始前必须先用10—20%甲醇水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡;分析结束后必须先用10—20%甲醇水冲洗30分钟以上,除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子(此描述只针对反相色谱柱)。

02

色谱柱的清洗及再生

如果色谱柱在使用一定时间后出现异常,包括峰形的变化、拖尾、峰分裂、肩峰、高背压或柱效的变化,用户可尝试按以下步骤进行清洗。

正相/HILIC色谱柱:

极性固定相(如SiO2,NH2, CN, Diol, Amide, Imidazole基色谱填料)的清洗再生程序:

第一步:50% 0.1 M醋酸铵,pH5/50%乙腈(5倍柱体积)

第二步:100% 0.1 M醋酸铵,pH5(5倍柱体积)

第三步:50% 0.1 M醋酸铵,pH5/50%乙腈(5倍柱体积)

第四步:100%乙腈(10倍柱体积)

第五步:100%异丙醇(10倍柱体积)

第六步:100%乙腈(5倍柱体积)

第七步:使用前用20倍柱体积的流动相平衡色谱柱

注意:

a.在对色谱柱进行清洗再生时,为了避免色谱柱上的污染物或其他物质进入流通池,需断开色谱柱与检测器之间的连接。

b.在对色谱柱进行清洗再生时,建议使用平时使用流速的10-50%进行操作,防止因溶剂粘度过大而造成柱压的激增。

c.当遇到高背压情况时,可以按上述程序进行反冲色谱柱。

反相色谱柱:

非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的清洗再生程序:

第一步:50%去离子水/50%甲醇或乙腈(5倍柱体积)

第二步:80%去离子水/20%甲醇或乙腈(5倍柱体积)

第三步:80%(含0.1%EDTA水溶液)/20%甲醇或乙腈(10倍柱体积)

第四步:80%去离子水/20%甲醇或乙腈(5倍柱体积)

第五步:100%甲醇或乙腈(5倍柱体积)

第六步:100%异丙醇(10倍柱体积)

第七步:100%甲醇或乙腈(5倍柱体积)

注意:

a.在对色谱柱进行清洗再生时,为了避免色谱柱上的污染物或其他物质进入流通池,需断开色谱柱与检测器之间的连接。

b.在对色谱柱进行清洗再生时,建议使用平时使用流速的10-50%进行操作,防止因溶剂粘度过大而造成柱压的激增。

c.当遇到高背压情况时,可以按上述程序进行反冲色谱柱。

d.在对NH2改性的色谱柱进行再生时,由于NH2可能以铵根离子的形式存在,因此应该在水洗后用0.1 M的氨水冲洗,然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

e.0.05 M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱,如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质,在水洗后加用0.05 M稀硫酸冲洗非常有效。

03

色谱柱的维护

a.使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)

b.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2-7.5,尽量不超过该色谱柱的pH范围

c.避免流动相组成及极性的剧烈变化

d.流动相使用前必须经脱气和过滤处理

e.如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相,应在实验完毕柱子冲洗干净,并保存于甲醇或乙腈中

f.氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。

在工作中,要好好爱惜色谱柱,没事多冲一冲色谱柱,不然它一发脾气,项目进度就.....玩完了 ~

篇幅问题,本文分上下两篇,敬请期待下期内容~

(本文部分节选于网络,如有侵权请联系删除,谢谢您的配合~)

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