构建酵母cDNA文库你需要注意的

在大数据盛行的时代，通过各种测序及芯片技术等，很容易就获得了一大把差异表达基因。然而很多同学不知道怎么研究基因功能（当然也许是因为懒）只是粗浅的检测一下功能表型，就草草的投稿了，这浪费了许多优秀基因资源。如果在此基础上，进一步去研究蛋白相互作用，就会使文章更具深度。蛋白质互作的研究方法有很多，比如酵母双杂交、免疫共沉淀、pull-down技术、双分子荧光互补等。而在已知某感兴趣基因（蛋白）时，想研究其如何在细胞中发挥功能，通常会选择酵母双杂交，从cDNA文库中钓取与之相互作用的蛋白。今天我们就来讲讲酵母cDNA文库的构建。根据RNA量的多少，可以选择使用invitrogen或clontech的试剂盒。今天我们先介绍在RNA量少的情况下，利用clontech试剂盒的建库方法。

文库构建从RNA提取开始，完整的mRNA对获得高的cDNA合成效率和文库质量是至关重要的。所以RNA提取后一定要进行质检，可以通过测定260 nm和280 nm的吸光度（A260/A280在1.8～2.1是理想值），或使用琼脂糖凝胶电泳法对RNA的纯度进行检测。欧易生物采用2100质检来对RNA质量进行把关。

获得RNA后就要进行反转录和二链合成，利用的是SMART技术（即RNA模板5''末端转换机制），可以连续合成5''非翻译区的序列，包含了更大比例的全长克隆。在这两步过程中最需要注意的是防止污染。因为使用的引物具有非特异性特点，如果反应体系中有DNA污染，PCR扩增后后果会很麻烦。

防止污染及消除污染的方法有以下几种：
1．合理分隔实验室：样品的处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开，实验室最好能划分为：
      a．样品处理区 
      b．PCR反应预混液配制区 
      c．PCR循环扩增区
      d．PCR产物鉴定区注意：各实验用品及移液器应分区专用；实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。 

2．移液枪：由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

3．PCR试剂：每次使用时要多加小心，避免带入污染。

4．Eppendorf管：应选择质量好的Eppendorf管。

5．防止操作人员污染：使用一次性手套、枪头及离心管等。

6．避免样本外溢及外来核酸的进入：打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体离心至管底部，同时开管动作要轻，以防管内液体溅出。

7．适当的PCR循环次数。 

8．设立适当的阳性对照和阴性对照实验。

二链合成后进行片段筛选，可以使用DNA分选柱CHROMA SPIN TE-400 column ，也可以通过切胶回收的方法筛选1000bp-2000bp的片段。

最后将获得的cDNA文库与AD载体共转化进酵母细胞中即可以完成酵母cDNA文库的构建了。文库构建好后，可以通过滴度鉴定文库库容量，PCR和测序鉴定文库质量。

此外，需要补充的是，通过二链与pGADT7共转酵母获得的酵母AD文库，进行筛库时只能使用mating方法。如果在转酵母之前，先将cDNA文库重组到AD载体上再通过大肠杆菌扩增，就可以获得含有cDNA的文库质粒和大肠杆菌文库菌液了。这样文库可以更方便保存和鉴定，且在筛库时除了可以使用mating法，还可以直接通过共转法。好了，今天小编就介绍到这儿，下回为大家介绍invitrogen的建库方法。

参考：clontech Make your Own“Mate & Plate” Library System

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