「单细胞决策树」这一份研究攻略你必须要看！

2022-07-30 07:59:48 上海欧易生物医学科技有限公司

随着单细胞测序技术兴起，技术已日臻成熟，单细胞转录组测序凭借着可以揭示单个细胞的基因表达状态、反映细胞间异质性的优势，已经成为分子高通量测序的重要研究手段，也是当下研究的热点技术之一，可以说是科研路上的一把「利器」。但与此同时，产生的数据呈现爆发式增长，常常面对着大量的数据，熬夜熬到眼眶发黑，却仍束手无策。加上不同悬液制备方法得到的细胞/细胞核悬液不仅在数量和活性/杂质等结果表现不同，还会在某些转录信息上表现不同。「救命！我需要一份单细胞研究攻略，助我一臂之力，早日啃下这块硬骨头。」那么，欧易生物研发团队整理了详细的「单细胞决策树」，你值得拥有！让你看完直呼惊喜！

单细胞（核）悬液制备是关键步骤

在单细胞转录组测序实验中，「输入」的细胞是单细胞测序的核心，制备细胞、细胞核是单细胞测序的关键步骤。

温浴酶解法的双重优势：应用广泛 + 经验丰富

酶解法在获取细胞悬液方面与研磨等方法相比，有着得率高、活率高等特点，早期高通量单细胞测序制备组织单细胞悬液的主要方法便是酶解法。酶解法的核心是通过蛋白酶破坏细胞外基质、组织中细胞间的连接，从而达到分离组织中细胞的目的。大家所熟知的蛋白酶种类有胶原酶 I、II、III、IV 等、胰酶、弹性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等，早期实验用蛋白酶均在～37 ℃ 环境有较高的酶活，酶解过程需要在～37 ℃ 环境中进行，又称温浴酶解法。

图 1 | 引自《Organelles | Biology for Non-Majors》；细胞外基质的主要成分（细胞外基质主要由蛋白聚糖 Proteoglycan；结构蛋白 Collagen、elastin；粘连糖蛋白 glycoprotein 构成）

温浴酶解法作为被应用最早、最多的制备单细胞悬液的实验方法，积攒下许多有价值的经验，例如：worthington-biochem 网站中收录着不同物种、超过 30 种组织的应用实例（图 2 左），这给单细胞测序实验提供了极具价值的参考。

图 2 | 酶解法参考网站预览（网站中收录着 30+ 种组织类型的酶解方法和对应文献）

温浴酶解后细胞转录本真实性受到质疑

温浴酶解过程中，蛋白酶在 37 ℃ 环境中分离细胞时，蛋白酶和细胞内酶都处于高活性状态，细胞会在酶解过程中对环境中蛋白酶的刺激、以及物理条件如摇晃等做出响应，这将会导致转录本信息的失真^[3-5]。Susanne C van den Brink^[3]等通过 scRNA-seq 鉴定了两个细胞亚群，分析发现亚群 2 的细胞中表达了高水平的即时早期基因、Socs3 和热休克蛋白（HSPs），但在单分子 RNA 荧光原位杂交实验（smFISH）中无法得到验证。随着研究的深入，Elena Denisenko^[5]等提出了解决转录本失真的实验方案。

低温酶解方案可「冻结」细胞转录信息

低温酶解方案使用在耐寒菌株中纯化得到的复合蛋白酶替换温浴酶解法中的蛋白酶，低温酶解过程中的 4～6 ℃ 环境温度可以抑制胞内酶的活性，降低应激应答水平。O''Flanagan C H 等人发现热解离法引入基因表达模式的改变，而低温解离法较好地维持了基因表达的稳定^[3-6]。目前已被验证可以使用低温酶解法开展实验的样本类型囊括了大多数常规的组织类型。

图 3 | 38 个基因在 4 种不同条件下解离后的表达均发生了变化

图 4 | 低温酶解应用实例（酶解效果与温浴法无明显差异）

低温酶解方案可以避免批次效应

Mike Adam^[4]等人在实验中发现胶原酶酶解和长酶解时间都将诱导应激基因表达，不同的酶解时间会诱导不同的表达水平，这是批次效应的因素之一。在低温酶解方案中，酶活限制了细胞应激应答，不同酶解时间之间的基因表达水平相近。这一发现表明了低温酶解可避免批次效应。

图 5 | B. Log fold changes of a 2-h vs. 30-min digestion for collagenase only as a function of log counts-per-million.

C.Log fold changes of a collagenase vs. cold protease digestion at 30-min digestion time as a function of log counts-per-million.

D. Log fold changes of a collagenase vs. cold protease digestion at 2-h digestion time as a function of log counts-per-million.

E. Log fold changes of a 2-h vs. 30-min digestion (collagenase only) compared to a collagenase vs. cold protease digestion at 2 h demonstrate a large overlap between genes affected (ρ = 0.8)

「转录抑制剂⁺」阻止转录发生，温浴下实现无（低）应激应答

「转录抑制剂 + 实验方案」：将转录抑制剂加入温浴酶解体系，阻断转录本的合成过程，实现温浴下的无（低）应激应答。这一技术方案目前也已经得到了验证和报道，证实了转录抑制剂的引入可以有效地「阻止」应激应答发生^[7]。

图 6 | 转录抑制剂分子化学结构式

表 1 | 转录抑制剂分子作用机制

转录抑制剂⁺方案同样适用于植物单细胞（原生质体）转录组测序实验。综上可知，「转录抑制剂⁺」方案制备原生质体能够有效避免外界刺激（制备过程中涉及机械离心，抽打混匀、解离温度等，这些因素会引起原生质体的转录组在解离过程中发生较大变化）导致的「假阳性」。

图 7 | 拟南芥叶片「转录抑制剂⁺」对照组与实验组差异基因的表达情况热图（S1：无抑制剂组、S2：抑制剂）

酶解法单细胞测序实验存在解离偏好性

组织中细胞外基质的多样性和细胞间连接的多样性决定了酶解法存在偏好性，例如肺组织中的非驻留免疫细胞（T、B 淋巴细胞等）在组织中结合简单，酶解过程中属于易被酶解得到的细胞，而肺泡上皮细胞结合「牢固」，要在胶原酶、弹性蛋白酶共同作用下才能得到有效酶解。解离偏好性限制了对组织全面信息的获取，2011 年，Navin^[8]等开发了一种无解离偏好性的单细胞核测序方案。

单细胞核转录组测序实验（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）操作简易、无偏好、适用组织类型广泛

细胞核悬液的制备方法是使用裂解液（主要成分为非离子型去污剂如 NP40、Triton x100 ）去破坏细胞膜磷脂双分子层结构释放细胞核。纯化后得到的单细胞核悬液将用于 10 × genomics 等平台的文库构建、测序。对细胞核中 RNA 进行单个细胞水平的研究，制备细胞核悬液的方法无需考虑细胞活性问题。因此，snRNA-seq 已在多种组织类型得到应用^[8-11,39-44]，包括心脏^[12-15]、肾脏^[5,16-18]、PBMC 或培养细胞系^[19-21]、血管^[22]、胰脏^[23]、肺脏^[25]、以及多种肿瘤组织^[24]。细胞核结构相较于细胞膜的结构更加稳定，且裂解液加机械匀浆辅助的方法，组织中的细胞核将得到最大限度的释放。在小鼠的心肝脾肺肾组织中多次展开单细胞以及单细胞核悬液制备，结果显示细胞核数量远远多于细胞数量，不同类型的组织细胞核数量是细胞数量的 7～20 倍不等；细胞核实验方法可以使更多的细胞类型均能够得到有效回收和鉴定，帮助研究人员获取更加完整和全面的细胞图谱^{[16,25,26,37]}。这一点在多种组织类型中均能获得一致的结果，说明 snRNA-seq 的技术方案是稳定且可靠的^[5,24,27,28]。细胞核实验过程中通过保持低温和无核酸酶环境来保护细胞核内 RNA，即可很大程度上保障细胞核悬液的质量，因此经过 RNA 质检合格的样本均可以展开单细胞核 RNA 测序实验，同时因为样本在实验过程中细胞丧失活性，也可以避免样本中可能发生的应激应答^[5,29-31]。

图 8 | 细胞膜结构示意图

单细胞核转录组测序检出免疫细胞较少

2020 年，Michal Slyper^[24]等通过对多组样本单细胞核测序与单细胞测序之间的对比发现，神经母细胞瘤中，相比 SnRNA-seq，ScRNA-Seq 中免疫细胞比例更高，神经嵴、神经内分泌细胞等实质细胞大幅减少；而 SnRNA-Seq 结果中实质性细胞（尤其是恶性细胞）比例更高，但是 T 细胞比例大幅减少，B 细胞和 NK 细胞基本消失，内皮细胞、上皮细胞占比增加（图 9 左），这一发现在其余的 7 种组织类型中也得到了验证（图 9 右为乳腺癌样本）。

图 9 | sn-RNAseq 和 sc-RNAseq 细胞比例对比

关于单细胞核测序免疫学细胞检出低的现象有着大量的讨论，其中讨论热度最高的两个方面分别是 T、B 淋巴细胞为主的免疫细胞在这类组织中的占比远远低于实质细胞；另一种是制备细胞核悬液的方法不完全适用于这类免疫细胞^[32]。

「单细胞 + 单细胞核」实现更多的信息获取

同一组织同时开展单细胞和单细胞核测序（Sc-RNAseq + Sn-RNAseq）的实验方法是通过首先对组织全部投入进行酶解，收集易被解离的 T、B 淋巴细胞等细胞类型，紧接着对酶解后的组织进行收集，将无法得到酶解的细胞进行细胞核提取，分别进行单细胞 RNA 测序和单细胞核 RNA 测序，经过样本文库构建测试，结果是符合预期的，两个方法对同一组织展开实验得到的数据是有着互补的作用，从结果的细胞类型鉴定图示中我们可以得到，细胞核中检出的内皮细胞在细胞样本中未被检出，这一方法可以大大增加我们对一份组织中信息的了解，更多的信息也给生物信息学分析方法带来了更多的可能与机遇。在这个方案里仍然可以引入转录抑制剂的实验内容来避免应激应答对实验的影响。

图 10 | 「单细胞 + 单细胞核」转录组测序流程图

图 11 | 同一组织「单细胞 + 单细胞核」转录组测序结果（左单细胞，右单细胞核）

「exo⁺snRNA-seq」通讯组学助力阐释细胞相互作用

生物现象背后最根本的其实就是不同细胞之间的一个互作网络，但仅知道单个细胞的功能还不够，还缺少通讯信号。无论在正常生理还是病理过程中，外泌体都是一个最为关键的信号载体。所以我们只有把这两部分同时发掘出来，才能真正地挖掘出这个网络运作的机制。

图 12 | exo⁺sn-RNAseq 联合分析流程图

基于不同单细胞转录组测序产品实验特点创建的「单细胞决策树」。

图 13 | 决策树第一节点：可能性

液氮冻存后保存在超低温冰箱中的样本（可能包括珍贵的动物模型，稀有的临床手术样本、其中包括需要先收集标本而后开展研究内容的情况等），组织中细胞已经没有活性，但是这种保存方式可以很好的保持 RNA 的完整性，因此该类样本仍然可以选择单细胞核测序方案或单细胞核实验方案进行单细胞水平的研究，大幅提升样本的科研价值^[5,24,27,28]。在过去的两年中，公司完成了多例冻存时间长达 1～2 年的手术样本，其中包括心脏样本、眼周样本等。

图 14 | 决策树第二节点：科学性

对于需要富集某类细胞（如 CD45 富集免疫细胞，流式细胞仪富集功能类细胞等等）或者通过磁珠去除某类细胞后进行单细胞测序的样本都需要细胞有 90% 以上的活性，不适宜采用细胞核实验方案。使用蛋白酶酶解组织的方法去进行单细胞测序时，组织中游离的免疫细胞会得到充分的释放，在结果中就会反映出多数信息都来自于免疫细胞，那么对于希望控制免疫细胞数目的项目也可以用 CD45 进行免疫细胞与其它细胞的分离，去除免疫细胞，或通过某一比例混合，即将免疫细胞通过阳选后与阴选细胞（肿瘤等）进行特定比例混合后实验，可以让每种细胞的捕获数目都尽可能的满足需求。

从结果上来看，免疫细胞检出率这一方面单细胞转录组测序优于单细胞核转录组。进行特定细胞类型分选富集需要在细胞保持活性下进行。因此如果样本细胞需要经过富集步骤的话，要选择第三分支酶解法制备单细胞悬液。

对于没有富集需求的项目，单细胞核测序的方案具有无应激、细胞类型全面、无细胞直径限制、无需考虑细胞「脆性」（组织中承担功能的细胞会因为高度分化等原因对于存活条件要求较高，在酶解过程中被大量破坏而导致结果中该类细胞占比极低、如神经元细胞在被分离为单细胞后会很快丧失活性而导致结果中神经元细胞占比低，尤其是较为成熟的神经元细胞）等优点^[33,34]。因此对于无免疫或富集特殊细胞要求的项目来说，单细胞核测序有无应激、细胞类型全面、无细胞直径限制、无需考虑细胞「脆性」的优势[细胞核内成熟的带有 poly A 结构的 mRNA 丰度低于胞内的情况下（在加入内含子区域信息后，单细胞核项目的基因数并不会明显低于单细胞转录组测序项目从而弥补所得信息不足的情况）。

同一组织同时开展单细胞 + 单细胞核测序的实验方法可以得到组织中更加全面的信息。通过酶解法获得组织中易于酶解的细胞，进行单细胞测序实验，将酶解后的剩余组织制备细胞核，进行单细胞核测序，完成目前水平下获得单细胞转录组层面全面数据，同时兼顾多种类型细胞的单细胞测序^[32,35,36]。选择第二分支即 Sc-RNA seq 与 Sn-RNA seq。

图 15 | 决策树第三节点：真实性

单细胞转录组测序实验部分，组织离体后运输、组织酶解、细胞不断地使用试剂处理等都会对细胞产生刺激，诱导应激的发生。选择低温缓冲液保存的方式来降低样本离体到酶解前的应激应答。低温酶解可以「冷冻」细胞转录信息；「转录抑制剂+」技术方案让细胞进入转录「静默」，二者都可以进一步提高测序数据的真实性。

低温酶解方案不仅具有成本优势，且对于多批次样本会有更好的数据表现；「转录抑制剂+」的优势在于有大量的文献资料供参考，可以通过多种蛋白酶组合和延长酶解时间来得到足够多的细胞，且避免基因应激应答的发生。

图 16 | 决策树总览

抓住「单细胞+」机遇

单细胞测序的结果直接决定了我们对生物学问题的解答以及挖掘到的相应生物学机制的深度。随着研究的深入和应用的广泛开展，单细胞测序结果更加「真实」（无转录偏好）和「全面」（无细胞类型偏好），是技术演进和进一步发展的必然要求。面对「千姿百态」的各种有机体，根据具体的生物学问题和现象，去针对性的选择特定技术方法，将是未来开展高水平生物学研究的关键，对研究的质量有着根本性的影响。在当前单细胞技术升级的大背景下，欧易生物研发团队为即将到来的「单细胞+」时代勾勒「决策树」这一工具，希望能更好地帮助广大科研人员更有效地应用单细胞测序技术解析生命现象背后的原理与机制。

参考文献：

[1]. Method of the Year 2013. Nat Methods. 2014 Jan;11(1):1.

[2]. Method of the Year 2019: Single-cell Multimodal Omics. Nat Methods. 2020 Jan;17(1):1.

[3]. Susanne C van den Brink et al., Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017 Sep 29;14(10):935-936.

[4]. Mike Adam et al., Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts_ a molecular atlas of kidney development. Development. 2017 Oct 1;144(19):3625-3632.

[5]. Elena Denisenko et al., Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 2020 Jun 2;21(1):130.

[6]. O''Flanagan C H , Campbell K R , Zhang A W , et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses[J]. Genome Biology, 2019, 20.

[7]. Marsh S E , Kamath T , Walker A J , et al. Single Cell Sequencing Reveals Glial Specific Responses to Tissue Processing & Enzymatic Dissociation in Mice and Humans. 2020.

[8]. Nicholas Navin et al., Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 2011 Apr 7;472(7341):90-4.

[9]. Jeff Gole et al., Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nat Biotechnol. 2013 Dec;31(12):1126-32.

[10]. Diane M Bushman et al., Genomic mosaicism with increased amyloid precursor protein (APP) gene copy number in single neurons from sporadic Alzheimer''s disease brains. Elife. 2015 Feb 4;4:e05116.

[11]. Blue B Lake et al., Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nat Biotechnol. 2018 Jan;36(1):70-80.

[12]. Peng Hu et al., Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 2018 Oct 1;32(19-20):1344-1357.

[13]. Markus Wolfien et al., Single-Nucleus Sequencing of an Entire Mammalian Heart Cell Type Composition and Velocity. Cells. 2020 Jan 28;9(2):318.

[14]. Alan Selewa et al., Systematic comparison of Highthroughput Single-cell and Single-nucleus transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation. Sci Rep. 2020 Jan 30;10(1):1535.

[15]. Miao Cui et al., Dynamic Transcriptional Response to Injury of Regenerative and Non-regenerative Cardiomyocytes Revealed by Single-Nucleus RNA Sequencing. Dev Cell. 2020 Apr 6;53(1):102-116.e8.

[16]. Haojia Wu et al., Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis. J Am Soc Nephrol. 2019 Jan;30(1):23-32.

[17]. Parker C Wilson et al., The single-cell transcriptomic landscape of early human diabetic nephropathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Sep 24;116(39):19619-19625.

[18]. Blue B Lake et al., A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nat Commun. 2019 Jun 27;10(1):2832.

[19]. Christopher S McGinnis et al., MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nat Methods. 2019 Jul;16(7):619-626.

[20]. Jiarui Ding et al., Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):737-746.

[21]. Elisabetta Mereu et al., Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects. Nat Biotechnol. 2020 Jun;38(6):747-755.

[22]. Soumya Korrapati et al., Single Cell and Single Nucleus RNA-Seq Reveal Cellular Heterogeneity and Homeostatic Regulatory Networks in Adult Mouse Stria Vascularis. Front Mol Neurosci. 2019 Dec 20;12:316.

[23]. Luca Tosti et al., Single nucleus and in situ RNA sequencing reveals cell topographies in the human pancreas. bioRxiv 733964; doi: https://doi.org/10.1101/733964

[24]. Michal Slyper et al., A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 2020 May;26(5):792-802.

[25]. Jeffrey R Koenitzer et al., Single nucleus RNASeq profiling of mouse lung: reduced dissociation bias and improved detection of rare cell types compared with single cell RNASeq. bioRxiv 2020.03.06.981407; doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.06.981407

[26]. Barthelson R A , Lambert G M , Vanier C , et al. Comparison of the contributions of the nuclear and cytoplasmic compartments to global gene expression in human cells[J]. Bmc Genomics, 2007, 8(1):340.

[27]. Naomi Habib et al., Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nat Methods. 2017 Oct;14(10):955-958.

[28]. Blue B Lake et al., Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 2016 Jun 24;352(6293):1586-90.

[29]. Rashel V Grindberg et al., RNA-sequencing from single nuclei. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Dec 3;110(49):19802-7.

[30]. Benjamin Lacar et al., Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nat Commun. 2016 Apr 19;7:11022.

[31]. Dmitry Velmeshev et al., Single-cell genomics identifies cell type–specific molecular changes in autism. Science. 2019 May 17;364(6441):685-689.

[32]. Andrews T S , Atif J , Liu J C , et al. Single Cell, Single Nucleus and Spatial RNA Sequencing of the Human Liver Identifies Hepatic Stellate Cell and Cholangiocyte Heterogeneity. 2021.

[33]. Naomi Habib et al., Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 2016 Aug 26;353(6302):925-8.

[34]. Peng Hu et al., Dissecting cell-type composition and activity-dependent transcriptional state in mammalian brains by massively parallel single-nucleus RNA-seq. Mol Cell. 2017 Dec 7;68(5):1006-1015.e7.

[35]. Blue B Lake et al., A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Sci Rep. 2017 Jul 20;7(1):6031.

[36]. Anupama Sathyamurthy et al., Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Rep. 2018 Feb 20;22(8):2216-2225.

[37]. Trygve E Bakken et al., Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 2018 Dec 26;13(12):e0209648.

[38]. Selewa A , Dohn R , Eckart H , et al. Systematic Comparison of High-throughput Single-Cell and Single-Nucleus Transcriptomes during Cardiomyocyte Differentiation[J]. Scientific Reports, 2020, 10(1).

[39]. Hansruedi Mathys et al., Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer’s disease. Nature. 2019 Jun;570(7761):332-337.

[40]. Jellert T Gaublomme et al., Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nat Commun. 2019 Jul 2;10(1):2907.

[41]. Rebecca D Hodge et al., Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 2019 Sep;573(7772):61-68.

[42]. Coco Chu et al., The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 2019 Oct;574(7779):543-548.

[43]. Alexandra Grubman et al., A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer’s disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nat Neurosci. 2019 Dec;22(12):2087-2097.

[44]. N. Thrupp et al., Single nucleus sequencing fails to detect microglial activation in human tissue. bioRxiv 2020.04.13.035386; doi: /10.1101/2020.04.13.035386