项目文章 | 蚕丝合成和血淋巴氨基酸代谢的联合分析揭示甘氨酸在蚕丝产量中的作用

2022-07-30 07:28:48, 小迈武汉迈特维尔生物科技有限公司

●发表单位：浙江省农业科学院蚕桑与茶叶研究所

●发表期刊：International Journal of Biological Macromolecules

●影响因子：8.025

●发表时间：2022.04.19

2022年4月19日浙江省农业科学院蚕桑与茶叶研究所陈学东、叶爱红等人为第一作者在International Journal of Biological Macromolecules上发表题为：“Combined analysis of silk synthesis and hemolymph amino acid metabolism reveal key roles for glycine in increasing silkworm silk yields”的研究论文，发现甘氨酸在调节家蚕产丝量中发挥着重要作用。迈维代谢为本文提供了氨基酸代谢谱检测分析服务。

家蚕是从野桑蚕驯化而来的，几千年来一直被用来生产蚕丝。家蚕丝是一种具有良好生物相容性和可降解性的天然纤维。近年来，纺织和(生物)医药行业对丝绸的需求不断增长。然而，传统的养蚕业受到工业污染、劳动力和桑树的短缺的影响。尤其是，桑叶收获季节短的问题，影响到了现代养蚕场的发展，削弱了养蚕业的生存能力。用配合饲料养蚕彻底改变了传统的桑树喂养策略, 克服了桑叶收获的季节限制。然而，仍存在有蚕丝生产效率低的问题，阻碍了配合饲料养蚕的工业应用。蚕丝产量是养蚕业关注的一个重要经济性状。丝腺(SG)是家蚕幼虫负责丝合成的主要器官，具有很强的蛋白质合成能力，氨基酸在丝合成中具有重要的调节作用。我们重点研究了饲料氨基酸组成对蚕丝合成的影响。在本研究中，我们确定了甘氨酸和苏氨酸是影响丝产量的关键氨基酸。通过结合血淋巴氨基酸代谢和丝合成分析，我们观察到甘氨酸通过促进SG DNA合成来增加丝产量。为深入了解氨基酸营养代谢与高效蚕丝合成的关系，进一步优化蚕饲料配方提供了依据。

1.配合饲料对蚕丝产量和丝蛋白组成的影响

与ML组相比，FF组的茧层重量和茧层比例分别降低了13.06%和4.19%，而蛹的重量增加了13.47%(Fig. 1a)。在FF和ML组中，丝纤维中的丝心蛋白水平约为73%(组间无显著差异)。FF组和ML组蚕丝的氨基酸组成相似(Fig. 1b)。在FF组和ML组中，主要氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸)占丝蛋白的90%。FTIR分析显示FF组丝心蛋白酰胺I区的二级结构与ML组没有显著差异(Fig. 1c)。这些数据表明，配合饲料降低了丝产量，但没有改变丝结构和氨基酸组成。

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图1 配合饲料对丝产量、丝蛋白组成和丝结构的影响

2.配合饲料对丝蛋白表达的影响

蚕丝主要由丝心蛋白和丝胶蛋白组成；丝心蛋白是丝蛋白的主要成分，占70%以上，主要在PSG中合成，由比例为6:6:1的Fib-H, Fib-L和 P25 蛋白组成。因此，PSG是研究配合饲料对丝蛋白表达影响的主要组织。qRT-PCR结果显示，在5L3之前，ML组Fib-H, Fib-L 和P25的表达相对较低(Fig. 2)但在5龄第4天(5L4)后迅速增加，表明家蚕主要在5龄中后期表达高水平的丝素蛋白。在5L3时，FF组的Fib-H、Fib-L和P25表达水平显著高于ML组(Fig. 2a)。从5L5到游走阶段(W)，FF组的Fib-H、Fib-L和P25表达水平显著低于ML组(Fig. 2a)，并表明在FF组中丝心蛋白表达的减少主要发生在5龄后期。

在5L5时， RpL18、RpSA和Tef2基因的表达与丝心蛋白表达正相关。如图所示(Fig. 2b)与ML组相比，FF组的RpL18、RpSA和Tef2基因表达显著降低，提示丝蛋白的合成在核糖体阶段受到影响。此外，与ML组相比，FF组在5L3和5L5的PSG DNA水平显著降低(Fig. 2c)，表明在用配方饲料饲养的昆虫中，PSG核内有丝分裂DNA合成受到阻碍，从而减少了丝蛋白合成。

丝心蛋白的表达量在FF组5龄后期减少，我们研究了自噬和凋亡是否发生在FF组PSG的这个阶段。Atg6和Atg8是指示自噬活性的标记基因，而Dronc和caspase-1是指示凋亡的标记基因。如图所示(Fig. 2d)，在5L5时Atg6、Dronc和caspase-1的表达在FF组和ML组之间没有显著差异。相比之下，FF组Atg8表达显著增加约120%，表明FF组PSG中自噬而非凋亡水平增加。Atg8是最下游的自噬基因，鉴于其在自噬体膜上的定位，它被用作自噬的标志物。Atg6是一个上游自噬基因，在自噬和凋亡之间的相互作用中起重要作用。Atg8表达增加而Atg6表达不增加的一个可能原因是配方饲料对PSG的损伤轻微，引起轻微的自噬，但不足以严重到诱导凋亡。

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图2 配合饲料对丝蛋白表达的影响

透射电镜分析表明 FF昆虫中5L5处PSG的细胞器结构与ML昆虫相似(Fig. 3a)。细胞核含有相对较高的核仁，染色质细丝呈线状结构。粗面内质网分布在整个细胞质中。一些高尔基体液泡是空的，而另一些则装载有丝心蛋白(Fig. 3a& b)。FF和ML差异的特征在于，在FF-PSG细胞中，有更多的自噬体和层状结构(自噬体前体)局部出现在腺腔附近，这表明在FF组昆虫的5龄晚期存在轻微的自噬(Fig. 3a&b)。这些观察结果与qRT-PCR自噬基因表达数据一致。

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图3 5L5时后部丝腺(PSG)细胞的电子显微照片

3.配合饲料中不平衡的氨基酸水平影响丝的合成

采用高效液相色谱法测定桑叶和配合饲料中的氨基酸组成(Fig.4a & Table S2).。我们观察到，配合饲料中17种氨基酸的水平比桑叶高38%(TableS2)。此外，配合饲料中的氨基酸组成与桑叶差异很大。蚕丝中主要氨基酸Gly、Ala、Ser和Tyr占配合饲料中氨基酸总量的17.39%，而桑叶中占22.65%。配合饲料中的谷氨酸(Glu)和精氨酸(Arg)含量(非丝蛋白主要氨基酸)分别为7.84%和1.72%，高于桑叶(Fig.4a)。这些差异可能是配合饲料中氨基酸向丝蛋白转化减少的原因。

蚕有一个开放的循环系统，血淋巴是所有器官和细胞的营养、能量和代谢的中间储存库。血淋巴中的氨基酸浓度取决于组织中蛋白质分解和氨基酸利用之间的平衡。为了了解FF组和ML组之间氨基酸代谢的差异，我们研究了5L5时血淋巴中的氨基酸及其代谢产物。定量分析了94种代谢物，确定了71种，其中琥珀酸、谷氨酰胺和鸟氨酸的水平最高(Fig.4b & Table S3)。与ML组相比，FF组的琥珀酸、谷氨酰胺和鸟氨酸水平分别增加了39%、25%和92%（Fig.4b)。琥珀酸是三羧酸(TCA)循环中的中间产物，三羧酸是氨基酸合成和转运的主要中间来源和能量供应。当给蚕喂配方饲料时，FF组中琥珀酸水平的增加表明氨基酸和糖或脂肪酸之间的转化增加。作为尿素循环的一部分，鸟氨酸在尿素生产和代谢中具有重要的功能。FF组鸟氨酸水平的增加表明尿素合成加快。

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图4 配合饲料对氨基酸代谢的影响

进一步的分析表明，25种代谢物在FF和ML组之间有显著差异(Fig.4c & TableS3)。这些氨基酸包括Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Glu、Arg和Thr在FF组中显著增加(Fig.4c)。与ML组相比，FF组昆虫血淋巴中的urea,Arg, Glu, ornithine以及Asp水平分别增加了628%、269%、163%、92%和72%（Fig.4d和Table1)，表明蚕在配合饲料中的尿素循环加快了。也表明了配方饲料中的氨基酸不平衡。

Table1 家蚕5龄幼虫在摄食120h时血淋巴中与鸟氨酸循环相关的氨基酸及其代谢产物的含量

4.甘氨酸对蚕丝产量的影响

氨基酸组成分析表明配合饲料中总氨基酸中Gly,Ala, Tyr, Thr, Val, Phe, Ile以及Leuproportions的比例低于桑叶(Fig.4a)。然而，FF组的血淋巴中的Ala、Tyr、Thr、Val、Phe、Ile和Leu水平高于ML组，而Gly在组之间没有显示出显著差异(Fig.44c和TableS3)。因此，我们猜测配合饲料中相对较低的甘氨酸水平可能降低了蚕的产丝量。

为进一步验证甘氨酸在蚕丝合成调控中的作用，在5龄幼虫配合饲料中添加不同浓度的甘氨酸。这些添加物显著增加了蚕的茧层重量和比率(Table2)，添加1.4%的甘氨酸效果最佳，茧层重量增加8.53%，茧层比率增加2.36%（Fig.5a 和Table2)。然而，当甘氨酸的比例达到1.8%时，大多数蚕不能正常吐丝结茧(Table2)。Thr可以通过Thr脱氢酶途径转化为Gly，在5龄幼虫配合饲料中添加不同浓度的Thr，添加0.6%Thr可使茧层重量和茧层率分别提高6.66%和1.11%。Thr浓度的进一步增加并没有增加这些指数，表明在丝合成过程中Thr的作用不如Gly强。此外，在配合饲料中增加Ala、Tyr、Val、Phe、Ile和Leu水平，与桑叶相近时，并不能增加茧层重量和比率(Table3)。

进一步的研究表明添加Gly增加了丝心蛋白基因、Fib-H、Fib-L和P25以及RpL18、RpSA和Tef2的表达(Fig.5b)。添加甘氨酸也避免了PSG细胞中的自噬(图S1)。我们进一步分析了甘氨酸对氨基酸代谢的影响，结果表明，在配合饲料(AA组)中添加1.2%的甘氨酸可使血淋巴中的丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和苏氨酸水平降低50%以上(Fig.5c)。此外，鸟氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和尿素水平(与尿素循环相关)分别下降了62%、85%、63%、48%和32%(Table1).因此，甘氨酸提高了配方中蛋白质转化为丝蛋白的效率，并减少了过量氨基酸通过尿素循环代谢为尿素。

Table2 配合饲料中添加甘氨酸和苏氨酸对家蚕经济性状的影响

Table3 配合饲料中添加Ala,Tyr, Val, Phe, Ile, 和Leu对家蚕经济性状的影响

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图5 甘氨酸在调节丝合成中的功能验证

5.甘氨酸对丝腺内有丝分裂DNA合成的影响

DNA通过核内有丝分裂的快速扩增发生在丝腺细胞中，并为快速合成高水平的丝蛋白提供必要的遗传物质。在配合饲料中添加1.2%的甘氨酸(AA)在5L5时，PSG中的DNA水平增加了20%以上(Fig.6a)。此外，当体外培养PSG以验证这些效果时，向培养基中添加1mmol/L的甘氨酸显著地促进丝腺DNA合成(Fig.6b &c)。磷脂酰肌醇3激酶(PI3Ks)和下游介质Akt和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是调节细胞增殖、存活和代谢的PI3K/Akt/mTOR信号级联的核心成分。先前的研究报道甘氨酸通过PI3K/Akt/mTOR信号影响组织发育，并且该信号与调节丝腺细胞中的DNA合成有关。因此，我们假设甘氨酸通过PI3K/Akt/TOR信号调节丝腺细胞的DNA合成。为了验证这一点，我们研究了甘氨酸对PSG细胞中Akt、S6K和4E-BP磷酸化状态的影响。蛋白质印迹显示1.2%甘氨酸增加5L3-PSG细胞中Akt和S6K磷酸化并抑制4E-BP磷酸化，而5L5-PSG细胞中Akt、S6K和4E-BP磷酸化不受影响(Fig.6d)。因此，甘氨酸通过PI3K/Akt/TOR信号促进了5龄早期丝腺中内有丝分裂DNA的合成。

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图6 甘氨酸对后部丝腺细胞DNA合成的影响

用配合饲料养蚕彻底改变了传统的桑树喂养策略。然而，仍存在有蚕丝生产效率低的问题，阻碍了配合饲料养蚕的工业应用。为了解决这个问题，我们从“氨基酸平衡”的角度探索了这些蚕丝产量下降的机制。发现氨基酸失衡是导致配合饲料饲养的家蚕产丝量下降的重要因素，而甘氨酸是控制产丝量的关键限制性氨基酸。我们的研究结果为解决困扰养蚕业多年的“配合饲料养蚕产丝量低的问题”提供了补救策略，可显著提高配合饲料养蚕业的经济效益。