2022-07-30 07:28:48, 小迈 武汉迈特维尔生物科技有限公司
●发表期刊:Anal Chem
●影响因子:8
●发表时间:2020.06
蛋白质和代谢物相互作用(PMIs)与许多细胞过程密切相关,在信号转导、调节物质和能量代谢中起着至关重要的作用。现有的PMIs分析策略大多涉及代谢物的化学修饰或蛋白质的固定化,这使得目前PMIs的研究主要局限于脂质-蛋白质和疏水代谢物。
本文建立了一种结合非靶向代谢组学的无标记在线动态体积排阻色谱-质谱(KSEC-MS)方法来定义复杂系统中的PMIs。将代谢物混合物和目标蛋白不经预孵育依次注入SEC色谱柱,用全谱代谢物图谱监测KSEC的分离结果。如果代谢物混合物中潜在配体的迁移模式受靶蛋白影响,并且这种变化与目标蛋白的浓度呈正相关,则可以发现代谢物潜在的配体。这种方法可以定位和识别复杂体系中的未知PMI。
KSEC-MS的概念描述见图1。蛋白质和代谢物在SEC柱中迁移速率显著不同。将代谢物混合物和目标蛋白依次进样到SEC柱中,不同分子在SEC柱中的迁移模式如图1A所示。在初始时刻T0,将代谢物混合物注入SEC柱,在短时间间隔之后,在时间T1将另一目标蛋白注入SEC柱中。因为蛋白质在SEC柱中的迁移速度比代谢物快,所以目标蛋白在T2和T3时追逐并最终通过代谢物的区域。在这个过程中,蛋白质与其配体相互作用形成蛋白质-代谢物复合物。由于游离蛋白质和蛋白质-代谢物复合物的分子尺寸相差不大,它们在SEC柱上共同迁移。当游离蛋白和蛋白-代谢物复合物超过游离代谢物复合物时,蛋白-代谢物复合物开始不断解离,并在游离蛋白和蛋白-代谢物复合物区域之后产生代谢物的踪迹。
因此,如果一个代谢物是目标蛋白的配体,它在SEC柱上的理论迁移模式应该类似于图1B。当利用在线质谱检测实时监测KSEC的分离结果时,洗脱的理论质量响应应如图1C所示。蛋白质-代谢物复合物在电离过程中被破坏并解离为游离蛋白质和代谢物。首先可以用质谱检测和定量代谢物的结合部分,之后,出现一个趋势严重的色谱峰,对应于代谢物从蛋白质-代谢物复合物及其游离部分连续解离出来的代谢物。
值得注意的是,迁移模式的变异程度与目的蛋白的浓度呈正相关。相反,如果一种代谢物不是目标蛋白的配体,它的色谱保留不会受到该蛋白的影响(图1D)。因此,其典型的萃取离子色谱图(EIC)仅由一个正常峰组成(图1E)。基于上述原理,利用非靶向代谢组学的方法,可以从一个复杂的系统中进一步定义和同时鉴定靶蛋白的多个配体,从而帮助研究者发现已知的和新的PMIs。
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图1
为了验证该方法,作者选择碳酸酐酶(CA)作为测试蛋白来验证KSEC-MS方法的可行性。CA可以催化二氧化碳与碳酸酐的可逆水合反应,将已知的CA抑制剂ACE加入到人血清中提取的代谢物中,利用KSEC-MS方法检验是否可以从复杂系统中确定已知的CA与ACE的相互作用。在不同浓度的CA下进行了多次KSEC实验。KSEC的总离子流色谱图并未随CA浓度的增加而发生明显变化,表明代谢物与CA之间不存在严重的非特异性相互作用。经数据处理后,以质谱负离子模式从原始数据中提取了384个代谢物特征。
当CA迁移模式的变化程度与CA浓度呈正相关,且两种不同的KSEC-MS实验(添加0μMCA/添加2 5 0μMCA)的峰面积下降率大于3时,确定了CA的潜在配体。根据上面的过滤规则,m/z为220.9785的化合物是从负离子模式的络合体系中定义出来的。随着CA浓度的增加,该化合物的色谱峰呈加宽和前移的趋势(图2A),而在18.82min左右的峰面积逐渐减小。
结果表明,该化合物在分离过程中可能与CA发生特异性的相互作用。随着分离过程的继续,CA-配体复合物开始解离,色谱峰出现前移趋势。此外,其迁移方式的变化程度与CA的浓度呈正相关。根据其准确的质量和MS/MS谱,初步推测m/z220.9785的化合物为血管紧张素转换酶ACE。因此,由KSEC-MS方法定义的CA的潜在配体(m/z220.9785)被确定为血管紧张素转换酶。其他代谢物的离子色谱图不受CA蛋白的影响,因此,没有来自代谢物混合物的其他代谢物被定义为CA的潜在配体。这一验证实验表明,基于KSEC-MS方法,可以从一个复杂的系统中定义蛋白质和代谢物之间的特异性相互作用。
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图2
为了进一步证明KSEC-MS方法在确定PMIs方面的有效性,选择HSA作为目标蛋白,从人血清中提取的代谢物中寻找其配体。
还采用KSEC-MS方法对全氟辛酸(PFOA)和全氟壬酸(PFNA)进行了定义和鉴定。这二者作为常见的环境污染物,通常通过食物、空气和水进入人体。全氟辛酸的色谱峰与十二烷二酸的色谱峰呈现相似的变化趋势。KSEC实验表明HSA和PFOA之间存在特定的相互作用。化合物(m/z412.9660)和全氟辛酸的质谱匹配结果证实了该鉴定。PFOA作为人血清白蛋白(HSA)的外源性配体,可能对内分泌、免疫和神经系统产生严重影响。
KSEC-MS方法是一种新的用来定位和识别复杂体系中的未知PMI,特别是极性代谢物与蛋白质的相互作用的方法。
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