2022-07-21 20:02:42, SCIEX SCIEX
鉴定和定量大量蛋白质和肽段对于了解生物功能具有重要意义,如通过大队列研究来筛选疾病生物标志物。由于体液、组织、细胞等生物样品的复杂性,数据依赖性采集(DDA)技术具有随机性,因此在进行蛋白质鉴定和定量时具有局限性。而数据非依赖性采集(DIA或者SWATH DIA)技术可以克服这一局限,尤其是Zeno SWATH DIA可使二级质谱灵敏度提高5-6倍左右,在进行复杂基质的蛋白质鉴定和定量时效果要优于DDA技术,这一优势在目前的短梯度、高通量蛋白质组学研究中表现得尤为突出。
为了满足高通量蛋白质组学研究需求,Evosep One系统(Evosep)提供了带有预设方法的标准化的液相,并舍弃了捕集柱,这一系统经过优化使得用户可以根据每天运行的样品数目(Sample Per Day, SPD)来选择合适的柱子、流速和运行时间,具有很好的重现性和稳定性,可以提高质谱的采集效率。我们使用ZenoTOF 7600系统连接Evosep One液相,应用Zeno SWATH DIA流程,进行高通量蛋白质组学研究,考察蛋白质鉴定和定量结果。
样本准备:HeLa细胞酶解产物。
液相方法:使用Evosep One 系统 (Evosep, Denmark)的预设方法,A相:水,0.1%甲酸,B相:乙腈,0.1%甲酸。
质谱方法:ZenoTOF 7600系统,采集模式:Zeno SWATH DIA,其中200 SPD、100 SPD 和 60 SPD方法使用微升流速,30 SPD方法使用纳升流速。
数据分析:Zeno SWATH DIA数据使用DIA- NN 1.8.1[1]软件处理,分别使用人细胞样品高pH反相分级Zeno DDA建库的数据库 (ZT Lib)、人的FASTA文件蛋白质序列理论库(in silico library,Lib Free,不建库)或者Pan Human数据库[2](PHL)进行数据分析。
主要结果:
1.
可以根据通量和覆盖深度的
要求选择不同的液相方法
随着样品进样量的增加,蛋白质鉴定和定量数随之增加。Hela样品在50ng较低进样量时,鉴定到的蛋白质中仍有高达70%以上都可以被定量,其中30 SPD的通量可以鉴定到5727个蛋白质(FDR<1%),定量到4232个蛋白质(CV<20%)。200ng进样量时,鉴定到的蛋白质90%左右都可以被定量,其中30 SPD的通量可以鉴定到7014个蛋白质(FDR<1%),定量CV<20%蛋白质6189个(图1)。
随着运行时间的增加,通量会降低,蛋白质组覆盖的深度增加,这与预期结果一致。当通量从200 SPD降到30 SPD时,对于50ng和200ng进样量,蛋白质鉴定数分别增加了102%和82%,蛋白质定量数分别增加了77%和80%。采用100 SPD的方法,进样200ng,仍然可以鉴定到5499个蛋白质,定量到4870个蛋白质,同时达到高通量和高覆盖深度。
图1. 进样量200ng(左图)和50ng(右图)
时不同液相条件下(SPD)蛋白质的鉴定和定量数目
图中透明条带代表FDR<1%时蛋白质鉴定数,实心条带代表FDR <1%和CV <20%的蛋白质定量数,上方橙色线代表蛋白质定量数占鉴定数的百分比。
2.
不同数据库分析结果的比较
使用DIA-NN软件进行数据处理,200ng进样量,分别用Lib Free 、PHL 和ZT Lib三种数据库进行分析,可以看到,使用谱图库和无谱图库蛋白质鉴定数和定量数基本一致(图2)。比较Lib Free(不建库)和ZT Lib(建库)的定量结果,二者有90%的蛋白质是一样的。
Zeno SWATH DIA在获得蛋白质鉴定结果的同时也可以获得定量结果,而使用library-free即不建库的方式进行搜索是一种很有效的数据处理模式,因其可省去建库的步骤。
图2. 200ng进样量 不同数据库分析结果的比较
上图:不同通量下三种数据库的鉴定和定量结果
下图:30 SPD条件下,使用Lib Free 和ZT Lib的定量结果(FDR <1%,CV <20%)
3.
不同进样量、通量条件下,
肽段定量结果比较
随后比较了不同进样量和通量条件下定量到的肽段数,当200ng进样量,200 SPD的通量可以定量到15000条肽段;30 SPD的通量可以定量到42000条肽段。当通量从100 SPD降低到60 SPD时,鉴定水平显著提升(增加43%)。60 SPD通量可平衡鉴定和定量。综合考虑通量和不同进样量的情况下,低进样量更有利于高通量分析(图3)。
图3. 不同进样量和通量条件下定量到的肽段数
//
ZenoTOF 7600系统由于具有Zeno trap功能,可以大幅提高二级质谱灵敏度,使用Zeno SWATH DIA采集技术可以实现更深的蛋白质覆盖度和定量重现性,与Evosep One系统结合,在蛋白质组学研究中可实现更高的通量和稳定性。
文献:
[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.
[2] Rosenberger G et al (2014) A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific data. 1, 140031.
声明:版权为 SCIEX 所有。欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容须获得授权, 转载时须注明「来源:SCIEX」。申请授权转载请在该文章下“写留言"。
喜欢就点在看哟
07-01 英斯特朗
连载 | 药物一致性评价与粒度分析(三)07-01 欧美克仪器
【仪器百科】LS-909丨干湿二合一激光粒度分析仪07-01 欧美克仪器
标准物质解决方案 | PFASs(全氟及多氟化合物)06-29
第九期阿尔塔有约 | 环境专题【新污染物:PFAS】技术研讨会精彩回顾及提问解答06-29
“绿色技术范式”,分析化学未来发展方向——访中国分析测试协会副理事长、辽宁省分析科学研究院原院长刘成雁教授06-29 转载仪器信息网
华西医院-标准型数显脑立体定位仪、双通道体温维持仪、体式显微镜安装完成06-29 迈越生物
科鉴检测助力2家仪器企业获得首批产品可靠性认证证书06-28 科鉴检测
德国耶拿:锂电池生命周期分析解决方案06-28 德国耶拿
AI已来!生命科学本科教学如何紧跟技术浪潮06-28 Opentrons
盛瀚售后,五星级服务的秘诀是什么?06-28 SHINE
专为汽车制造商打造的柔性解决方案——实现制程控制06-28
西北工业大学-脑立体定位仪安装完成06-28 迈越生物
会议邀请 | 第九届海上检验医师论坛06-28
卓立要闻 | 创新发展ing…6月卓立“大事小情”速览06-28 光电行业都会关注
打造信任合作伙伴!2024年度卓立汉光客户满意度调查开启06-28 光电行业都会关注
如何挑选适用于三阶光学非线性的测量系统?Z扫描测量系统来助力!06-28 光电行业都会关注
招聘启事—中国科学院沈阳自动化研究所微纳光学测量表征技术课题组06-28 光电行业都会关注
谱育科技作为主要完成方 荣获2023年度国家科学技术进步一等奖和二等奖06-28 点击关注→
仪器原理丨顶空仪与吹扫捕集仪科普小知识06-28 天美色谱