AAV滴度检测，耶拿可以做什么（上篇）——感染滴度检测

       基因治疗领域目前最常用病毒载体之一是腺相关病毒（AAV），以AAV作为载体开发基因治疗药物时，必须对多种关键质量属性进行检测，其中放行的最关键指标之一就是AAV病毒滴度测定，准确定量AAV载体病毒滴度对于临床前和临床剂量标准至关重要。

      AAV病毒滴度通常分为物理滴度和感染滴度。

      物理滴度一般是指基因组滴度或者衣壳滴度。通常采用qPCR或ELISA的方法进行检测。

      在感染滴度方面，AAV感染性滴度的金标准是采用TCID50细胞体外感染的方法。通常的实验流程是AAV样品通过梯度稀释,并在腺病毒的辅助作用下感染96孔板中携带rep和cap的靶细胞，通过qPCR扩增获取扩增信息从而判定感染的培养孔是否有阳性感染。通过起始滴度和基于病毒感染细胞的统计数值, 采用组织培养半数感染剂量公式—Spearman- Karber公式来评估感染滴度（也有其他计算公式，比如Reed-Muench Method、Improved Karber method等）。

       目前AAV采用TCID50方法面临的挑战是精密度差，变异系数大，对于质量控制检验而言，放行标准更难以建立，日常工作的稳定性考察也有很大的困扰。

       TCID50实验结果变异系数大是最难克服的挑战，通常文献发表的TCID50感染滴度结果%CV值＞70%，很多因素都会影响检测结果。

        一方面为了摸索更加稳定的放行标准，需要在诸如辅助病毒的稳定性、易感细胞的类型和接种浓度、培养液体积、培养的时间、后续检测体系筛选等等方面进行较多的条件摸索，工作量较大，对于QC方法开发的部门压力较大。另一方面体系建立以后，人员的培训熟练程度、实验室的背景污染、移液的精准度、流程重复完成的精确度等等都会影响检验结果，对于放行部门也有较大挑战。

      耶拿自动移液工作站Felix可以在哪些方面提高TCID50方法的可重复性、稳定性？

• AAV样品梯度稀释及分板：人工操作需要对每个AAV样品进行梯度稀释，在样品量较多时，工作量大，耶拿工作站Felix可以在这种重复工作中有效节约人工，并且完全在生物安全柜中完成，避免污染，同时通过仪器操作可以更好保证操作的一致性。梯度稀释后病毒样品需要再分装到4个或者更多复孔，也可以完全由工作站自动进行，提高重复性。

• 宿主细胞和腺病毒移液：如果涉及到整版或者较大工作量，可以通过工作站进行分板，同时进行多个96孔板移液，提高工作效率的同时，在生物安全柜中进行自动操作，避免实验室污染。

• 在方法开发过程中，需要摸索测试各种不同细胞系和培养液的量，使用Felix进行研发测试，由程序记录下具体过程，避免人工操作误差，可以及时追溯实验过程。

有兴趣的客户可在线留言或扫描以下二维码