ACD/Labs 质谱自动化分析流程指南

2022-07-15 10:26:10, ACD/Labs 葛师成 Advanced Chemistry Development, Inc. (ACD/Labs)

流程概述

此流程中需要的软件工具为ACD/MS Structure ID Suite的license，适用的分析对象是高分辨质谱的全扫描数据，适用的工作场景包括天然产物的质谱鉴定和浸出物和可提取物的定性研究。

一般情况下对于组分识别的样品，分析化学家都会使用Excel表格来记录需要重点关注的组分，表格中含有组分的结构以及相关信息。为实现高水平的自动化运行，需将此Excel表格使用ACD/Spectrus DB工具转换成重点关注组分结构数据库。在分析样品的全扫描的高分辨LC/MS数据时可以使用自动目标物识别功能检索此重点关注组分结构数据库，识别重点关注组分，识别出的组分经人工复核后将MS谱图推入到化合物MS标准谱图数据库中以备以后使用。化合物MS标准谱图数据库的来源可以分为两类，一类是上步流程中自动化+人工复核识别出的组分，另一类可以直接采集标准品的MS谱图。

化合物MS标准谱图数据库成规模后，工作流程做近一步的改进。样品的LC/MS数据可以用ACD/IXCR (IntelliXtract Component Recognition) 比对化合物MS标准谱图数据库中的MS标谱来准确识别组分。保留这些组分信息，对于还没能识别的组分接下来可以使用自动化质谱识别工具再次比对合理规模的通用型结构数据库获得更多的组分信息。分析完成后的LC/MS数据可以归档到数据库中。

以下工作流程默认用户尚未建立任何谱图数据库，计划从头进行知识库的构建。

第一步：建立重点关注化合物结构库

如何建成重点关注组分结构数据库？

可以将Excel文件转换成csv文件，在csv文件中必须有第一行的title，列中必须包含结构信息，可以为Smiles或Inchi，Smiles或Inchi可以来源于PubChem网站或由ACD/Chemsketch转换。下图为csv文件示例：

打开ACD/Spectrus DB组件，点击菜单栏中Database，下拉菜单中选择New新建一个空的数据库。

点击菜单栏中Database，下拉菜单中选择Import，选择目标csv文件。弹出的对话框中选择左下角Field Options

在弹出对话框中Structure Source的下拉菜单中选择csv文件中Smiles所在列的title。

点击OK，回到上一级菜单，再点击OK完成数据库转换，完成后的数据库如下图所示，包含结构以及相关信息。

第二步：自高分辨全扫LC/MS数据中自动化识别重点关注结构数据库的组分

打开LCMS数据

从开始菜单选择ACD/Labs MS Workbook Suite，打开MS Workbook Suite软件。将LC/MS原始数据拖动到软件界面中（本指南以Thermo Xcalibur数据为例）

在弹出的对话框中确保不勾选Show MSn data as Separate Traces，右边选项中选择MS1和MS2数据。

数据打开后请检查数据格式，如果为Profile格式，请选择菜单栏中Process\\ Convert Profile to Centroid，将文件转成Centroid格式。

选择菜单栏中Analysis\\Set Data Analysis Regions，设定数据分析保留时间区间，否则软件将分析整条数据。保留时间区间外的范围，软件将使用灰区进行显示。

选择菜单栏中Tools\\Automated MS Structure ID，启动AMSID功能

进入AMSID参数设定窗口，点击Run IntelliXtract 2.0后的option进入组分化工具参数设定窗口

可以在Minimum S/N Ratio for 12C Peaks中设定数据分析信噪比阈值，设定值越大对数据信噪比要求越高，建议比较合理的数值在10-20。Peak Shape Similarity中设定组分化工具判断组分是否单一的阈值（0-1），软件的初始值为0.5，数值设定越高，软件判定越严格同时会出现判断假阳性，数值设定越低，软件判定越松会出现假阴性，一些共流出的组分不能正确识别。Component Abundance Threshold中设定最小组分占最大组分面积百分比数据值，数据设定过大，软件会忽略小组分。勾选Interpret Components和Auto Detect Assignment Accuracy选项，软件会自动在组分的MS谱图上标注M+H以及各种加合峰和中性丢失峰，自动根据数据设定归属的MS精度。

在Mass Search Parameters选项中可以设定由分子离子峰检索结构时的MS精度，一般高分辨为5ppm，可以在Adduct Ion中设定软件优先分析的加合离子峰，一般情况下不需要特别设定。

在Elemental Composition中可以设定复核分子离子峰的化合物的原始组成和原子个数。如勾选了Exact Search则限定检索命中的结构必须符合设定元素组成和个数，如果不勾选Exact Search则检索到的结构不仅限于设定元素组成。

在Max Number of Hits中可以设定检索到符合分子离子峰的结构的最大数目，点击Specify Databases for Search，在弹出窗口中点击Add导航到上文中建立的重点关注结构数据库***.cfd文件添加目标数据库，支持.cfr .sed .cfd .nd9格式文件。

点击open添加数据库。

在添加的数据库列表中确保选择正确的目标数据库，注意这里可以添加选择多个数据库同时进行检索，点击ok，完成数据库添加。

确保勾选Apply Auto Assignment选项，此选项为对检索到符合分子离子峰的结构列表使用MS Fragmenter工具对组分的MS2谱图进行自动归属打分排序，选出最适合的结构式。点击此选项后的Options进行MS Fragmenter参数设定，如果为MS+的数据可以参考截图中的设定。

在MS Range中请合理设定MS分析的区间。

请根据实际的情况合理调整参数，如你分析的数据中含有特殊的基团，如硝基，亚砜，砜基请选择相应的选项。点击ok回AMSID窗口，再点击ok软件将开始运行处理数据，运行时间视数据复杂程度不等，请耐心等待。

数据处理完成后将看到下面的窗口。

如看不到组分列表窗口请点击

显示组分列表，可以看到组分列表中按保留时间顺序给出了组分识别结果，在Structure栏中给出了组分的结构式，在组分列表中选定一个组分，点击Structure Search Results将显示所有符合该分子离子峰的备选结构列表。

在Table of Structure Search Results中可以看到所有备选结构，点击d(MS)栏可以按照MS2谱图和结构的匹配度进行排序，在组分列表中显示的结构默认为排序第一的结构。用户可以在其它结构上右键选择菜单中Transfer to the Table of Components，将其它结构替换到组分列表中。

用户还可以在软件处理结果界面中组分的MS2谱图上右键选择Extract as single Spectrum

提取出该组分的MS2谱图。

在结构窗口中添加组分结构点击工具栏自动归属图标

自动归属MS碎片，观察MS归属谱图结果。

如果确认组分识别结果正确无误，可以将该组分的MS2谱图存入标准谱图数据库中。

第三步：将MS2指纹谱图存入标准谱图数据库

按照上文的步骤新建一个空的数据库，在确保新建数据库打开的情况下点击工具栏中更新数据库按钮

，将谱图推入到标准谱图数据库中；

双击Record Structure区域切换至Chemsketch，在Chemsketch中导入组分结构式，点击Update Record，更新标准谱图数据库中相应记录中的结构；

按照此上述步骤，添加其它组分的MS2谱图到标准谱图数据库中，注意在添加后续谱图时，请选择第一个选项Append MASS Spectrum as New Record。

如果用户使用标准品采集出的MS谱图也可以按照此方法将谱图推入到标准谱图数据库中。

第四步：将LC/MS数据存入数据库归档

待数据分析完成后可以点击菜单栏中 File\\Save as，将数据存成.spectrus文件，也可以将数据存入数据库中归档。

新建一个空的数据库，保证此数据库打开的情况下切换至数据分析结果窗口点击工具栏中数据库更新按钮

，将数据存入数据库中。

当标准谱图数据库建立完毕后的新流程

第一步：使用化合物标准谱图数据库进行组分识别

按照前述步骤打开数据文件，完成数据格式转换，设定合适的分析区间。点击工具栏中IXCR图标

，进入智能化组分MS谱图比对识别参数设定；

在此参数设定窗口中可以看到最初几项均为组分化参数设定跟之前的AMSID中相应的参数一致，请参阅相关说明进行调整。在Components Identification Options中可以设定要求比对MS谱图的类型为MS1或MS2，如果在数据存在MS2谱图的情况请优先考虑比对MS2谱图，勾选Combined Spectrum选项。在CE Filter选项中用户还可以规定MS谱图CE值。在HQI Threshold栏中可以规定实验MS谱图跟标准数据库中MS谱图的相似度阈值，设定值越高谱图的相似度要求越高，请合理设定此参数。点击Specify Databases 按钮可以添加标准谱图数据库，点击Add Local导航到标准谱图数据库***.cfd文件，完成数据库添加。注意可以添加多个标准谱图数据库同时进行检索。

如果您的数据为GC/MS数据可以勾选Apply NIST MS Search，软件将调用本机的NIST数据库MS Search程序进行数据库比对。

点击ok开始执行标准数据库比对；

如看不到组分列表窗口请点击

显示组分列表，选择组分列表中Structure栏中有结构的组分，可以看到软件将组分的实验MS2谱图和标准谱图数据库中MS2标准谱图进行镜像比对，同时在组分列表中HQI栏中显示两者的谱图相似度，方便用户进行确认。

在标准谱图数据库比对完成后，组分列表中有些组分已经识别出结构，但还有部分组分没有识别出结构。此时就需要在保留标准谱图数据库比对组分识别的结果的基础上，再进行一次通用结构数据库AMSID识别。

第二步：标准谱图数据库比对结果的基础上再进行通用结构数据库AMSID识别

再次选择菜单栏中Tools\\Automated MS Structure ID，启动AMSID功能

进入AMSID参数设定窗口

由于需要保留IXCR标准谱图数据库比对结果，请不要勾选Run IntelliXtract 2.0选项，其它参数设定跟上文中AMSID参数设定类似，请参阅相关步骤。

点击ok运行软件。

完成数据分析后，查阅组分列表，在Comment栏中如存在Query (MS2 combined): 30.0 eV (hcd); Hit (MS2 combined): 30.0 eV (hcd)字样，同时在HQI栏中有数值，则表明此组分的结构由IXCR比对标准谱图数据库识别出的，如果在这两栏中没有信息则此组分的结构为AMSID识别通用结构数据库而来。