2022-07-15 08:30:20, 星标关注 上海欧易生物医学科技有限公司
2021 年 2 月,北京市农林科学院任毅副研究员和许勇研究员为共同通讯作者,在 The Plant Cell (IF: 9.618) 杂志发表了题为“Evolutionary Gain of Oligosaccharide Hydrolysis and Sugar Transport Enhanced Carbohydrate Partitioning in Sweet Watermelon Fruits”的研究论文,报道了西瓜果实中寡糖水解、转运和存储的分子机制。
文章中酵母单杂交实验由欧易生物协助完成。
研究背景
大多数植物通过韧皮部将光合作用产物如蔗糖从源组织运输到库组织中,而在西瓜等葫芦科植物中运输的主要是棉子糖家族寡糖(Raf family ologosaccharides, RFOs)。
RFOs 经韧皮部运输到库组织中,以蔗糖和半乳糖的形式储存。但 RFO 如何水解,以及蔗糖和己糖在韧皮部、细胞膜和液泡膜中如何跨膜转运,机制尚未完全阐明。
研究内容
相互嫁接实验显示,RFO 在栽培西瓜果实中被水解,但野生祖先种的果实中存在“滞留”。通过全基因组关联分析,在维管束中特异性表达的碱性α-半乳糖苷酶 ClAGA2 被确定为控制 RFO 水解的关键因子。ClAGA2 启动子中的两个 SNPs 影响转录因子 ClNF-YC2 调节 ClAGA2 表达。此外,本研究表明己糖最终将被糖转运蛋白 ClSWEET3 和液泡膜糖转运蛋白 ClTST2 分别介导在质膜糖转运和糖储存。敲除 ClAGA2、ClSWEET3 和 ClTST2 影响果实糖积累。基因组特征表明,碳水化合物分配相关基因 ClAGA2、ClSWEET3 和 ClTST2 是西瓜野生种驯化到栽培甜西瓜过程中选择的关键基因。
研究结果
01
野生西瓜果实中 RFO 存在“滞留”
收集西瓜茎和临近果荚中维管分泌物进行检测,结果显示维管分泌物中运输的主要糖是 RFO(图 A),但 RFO 在果实中的含量极低(图 B),因此推测 RFO 在西瓜果实中发生了水解。
与栽培甜西瓜品种相比,野生非甜西瓜品种果实中 RFO 含量更高,茎和果柄中 RFO 浓度更低。表明栽培甜西瓜果实具有更强的 RFO 水解活性和更高的运输能力,可以将更高浓度的碳水化合物转移到果实中。
为了研究 RFO 在哪个组织中被水解,进行了相互嫁接实验。将栽培西瓜幼嫩果实嫁接到野生西瓜,结果显示果实糖含量与栽培西瓜自嫁接没有明显差别;同样,野生西瓜幼嫩果实嫁接到栽培西瓜,果实糖含量与野生西瓜自嫁接没有明显差别(图 C-D)。表明 RFO 的水解发生在果实中。
同时对 135 个代表性西瓜品种果实中 RFO 含量检测显示,野生非甜西瓜果实中普遍存在 RFO 的“滞留”,而栽培甜西瓜果实中 RFO 含量极低(图 E)。
图 1 | RFO 在果实中发生水解
02
ClAGA2 有助于 RFO 水解
对上述 135 个代表性西瓜品种的 RFO 糖含量进行 GWAS 分析,在 4 号染色体鉴定到一个显著关联的 SNP,该 SNP 位于碱性 α-半乳糖甘酶 ClAGA2 基因的启动子中(图 A)。RNA-seq 结果显示,栽培西瓜果实中 ClAGA2 表达量在授粉后显著上升,但在其他组织和野生西瓜果实中表达水平较低(图 B)。
原位杂交显示 ClAGA2 主要表达于韧皮部、维管薄壁细胞,但在果实贮藏细胞中没有明显表达(图 D)。表明 ClAGA2 可能是一个维管束定位的负责果实中 RFO 水解的蛋白质。
酶活检测显示,ClAGA2 在栽培西瓜果实中活性较高(图 E),具有较强的 RFO 水解活性(图 F-G)。注射 α-半乳糖甘酶抑制剂 DGJ,可以显著抑制 ClAGA2 活性,抑制 RFO 的水解(图 H-I)。以上结果表明 ClAGA2 是介导西瓜果实中 RFO 水解和糖累积的关键酶。
图 2 | ClAGA2 的定位、表达模式和功能分析
与对照相比,在半野生型西瓜中过表达 ClAGA2 后,果实更早变红,ClAGA2 表达水平和 α-半乳糖甘酶活性更高(图 A-C),同时果实中 RFO 含量降低、蔗糖含量增加(图 D)。
相反,利用 CRISPR 在栽培西瓜中敲除 ClAGA2,突变体 claga2 果实中 RFO 含量与野生西瓜相当(图 E-F),蔗糖、果糖、葡萄糖含量显著降低(图 G),生物量降低、种子萌发延迟并且种子萌发率降低(图 H-J)。
图 3 | ClAGA2 促进了西瓜中糖的分配
03
ClNF-YC2 调控 ClAGA2 的表达
为了筛选调控 ClAGA2 表达的转录因子,利用酵母单杂交技术进行了筛选,结果显示转录因子 ClNF-YC2 可以结合到 ClAGA2 的启动子。进一步利用酵母单杂交、EMSA、双荧光素酶报告实验证实,ClNF-YC2 能特异性与栽培西瓜的 ClAGA2 启动子的 -159 (C-T) 和 -170 (C-T) motif 结合(图 A-C、H-I)。草莓果实中异源表达显示,ClNF-YC2 可以激活栽培西瓜的 ClAGA2 启动子上游 500bp 序列(图 D-E)。以上结果表明,ClAGA2 启动子中 motif 序列中 SNP 与栽培西瓜结合活性相关。
图 4 | ClNF-YC2 调控 ClAGA2 的表达
04
ClSWEET3 通过果实薄壁细胞的质膜转运己糖
突变体 claga2 果实中 RFO 含量与野生西瓜相当,但蔗糖、果糖、葡萄糖含量显著降低(图 3 F-G)。比较两者基因表达谱,结果显示 claga2 中编码蔗糖代谢通路关键酶的基因存在显著表达差异(图 A),其中 ClSWEET3 是已知的糖转运蛋白基因。授粉后伴随糖含量的增加,ClSWEET3 表达量显著上升(图 B)。在 100 个核心种质资源中,ClSWEET3 表达量也与糖含量存在正相关(图 C)。进一步的 RT-PCR 定量显示 ClSWEET3 仅在西瓜果实薄壁细胞(贮藏细胞)中表达(图 D)。亚细胞定位显示 ClSWEET3 主要定位于质膜(图 E),并且具有转运己糖的能力(图 F-G)。
在野生型西瓜中过表达 ClSWEET3,结果显示果实变红、糖含量增加(图 H-I)。与之相反,clsweet3 突变体果实生物量降低、糖含量降低,但 RFO 含量未有明显变化(图 J-L)。
以上结果表明,ClSWEET3 是西瓜薄壁细胞中质膜定位的己糖转运蛋白。
图 5 | ClSWEET3 促进糖累积
05
ClAGA2、ClSWEET3、ClTST2 对于糖累积起到不同影响
ClTST2 是一个已经报道的、液泡膜定位的蛋白,负责将糖存储在液泡中。cltst2 突变体果实着色延迟、糖含量降低(图 A-C)。ClTST2 也主要表达于果实薄壁细胞中(图 D)。
结果显示,claga2、cltst2、clsweet3 突变体均呈现果实生物量降低、糖含量下降(图 E),双突变体、三突变体表型缺陷更为显著(图 F)。
图 6 | ClAGA2、ClSWEET3、ClTST2 的不同作用
研究结论
有关西瓜果实中寡糖水解和糖转运,本研究提出了一个新的模型:RFO 通过维管束进行运输,在 ClNF-YC2 调控下 ClAGA2 将RFO 水解为蔗糖和果糖,糖转运蛋白 ClSWEET3 将水解后的己糖转运到果实贮藏细胞中,接下来 ClTST2 将己糖转运到液泡进行存储。
参考文献
Ren Y, Li M, Guo S, et al. Evolutionary gain of oligosaccharide hydrolysis and sugar transport enhanced carbohydrate partitioning in sweet watermelon fruits. Plant Cell 2021; doi: 10.1093/plcell/koab055
06-18 TESCAN中国
解决临床创新“卡脖子”难题,丹纳赫重磅推出医院创新转化解决方案!06-18
徕卡精准空间生物学解决方案 第三弹06-18 郑晓业、童昕
618 嗨购一起“徕” | 网上商城活动来袭!06-18 徕卡显微系统
【培训活动】显微镜成像高阶培训系列(一) 共聚焦多维度成像技术解决方案06-18 徕卡显微系统
【展会】第十五届中国医师协会骨科医师年会06-18 徕卡显微系统
【直播预告】第十届电子显微学网络会议06-18 徕卡显微系统
【案例研究】双视野光片显微镜,适用于类器官及胚胎06-18 徕卡显微系统
议程确定|第四届锂离子电池热测试主题研讨会06-18
文献解读|安徽理工大学马衍坤教授团队《煤炭学报》:震动载荷多次作用下烟煤孔裂隙结构演化特征试验研究06-18 纽迈分析
中国的新质生产力正在服务全球市场!GE医疗北京基地CT交付量达3.5万台/套06-17
兰格ACHEMA 2024展会回顾:探寻精密流体传输市场新机遇06-17
宝英科技推出VOCs治理设施精细化管理实施方案,助力重点行业企业绿色升级06-17 宝英科技
赛默飞X先锋“肽”势:多肽药物研发与创新研讨会06-17
一省检验检测行业营收突破160亿元!06-17
仪器租赁 | 沃特世 液质联用,月租金52000元起06-17
不同行业实验室“以旧换新”,涉及哪些仪器设备?06-17
目标!检验机构总营收超100亿!06-16
一张“A4纸”售价高达万元,这家第三方检测公司是怎么做到的?06-15
GLMY创想仪器丨参加东北地区铸造年会06-15 国产精密仪器厂家