100% 原生质体制备成功秘诀

在单细胞悬液制备中，最难制备的莫属原生质体制备了。为解决这一难题，今天小欧根据以往的经验，给大家带来一次教科书级别的关于如何制备高质量原生质体的分享。

原生质体介绍

1、什么是原生质体

原生质体 (protoplast)：脱去细胞壁的细胞称为原生质体，它是一个生物工程学的概念，是组成细胞的一个形态结构单位，动物细胞也可算做原生质体。在细胞学历史上，“细胞”(cell) 一词最早由 Hooke 提出的，意为“小室”，后来发现了原生质，对细胞的认识与 Hooke 时期不同了，1880 年由 Hanstein 提出“原生质体”一词。由于细胞一词的出现较原生质体早，故沿用至今。

2、获得原生质体有什么重要作用

原生质体应用非常广泛，例如：由于细胞壁会阻止 DNA 进入细胞，原生质体被广泛用于 DNA 转化；可用于研究生物膜，包括高分子和病毒的摄取；用于体细胞的变异克隆；使用原生质体融合技术将原生质体用于植物育种等；此外，在某些细胞中表达荧光蛋白的植物的原生质体可用于荧光活化细胞分选（FACS），方便保留特定波长发荧光的细胞。

另外，原生质体是一种非常好的瞬时表达系统。原生质体瞬时表达技术被广泛应用于基因功能研究、植物生理生化过程研究和分子机制的研究（包括研究细胞信号转导过程、离子转运、细胞壁合成、蛋白质分泌以及细胞程序化死亡等生物学过程），以及生产有用的代谢产物、构建植物融合细胞、创制多倍体等。

现在已有的基于原生质体的实验技术包括蛋白亚细胞定位分析、基因瞬时表达分析、启动子活性分析、离子吸收实验以及蛋白质互作验证（如 Bi-FC、FRET 和蛋白质免疫共沉淀）等。

3、目前原生质体获得存在哪些限制

植物细胞壁不易破坏分解，叶绿体含量太高，碎片杂质占比太高以及容易被染菌等，成为当下植物解离获取原生质体的几大阻碍，如何高效获取高质量原生质体成为当下亟需攻克的实验难题。

酶解法

酶解法以其得率高、活率好、杂质少的特点毋庸置疑成为原生质体制备的首要方法。下面就由小欧向大家分享一下植物原生质体解离的独家秘方。

酶解法分离原生质体的灵魂就是酶分解细胞壁。植物细胞壁的组成分主要是纤维素、半纤维素、果胶、蛋白质等。选择植物原生质体分离用酶主要有：纤维素酶 R-10、半纤维素酶 、果胶酶 Y-23、离析酶 R-10 及崩溃酶等 , 其中纤维素酶 R-10、果胶酶 Y-23 最为常用。叶片类组织样本解离时，在酶解液中添加半纤维素酶可以提高消化效率；根系组织解离时，在酶解液中添加离析酶并适当提高果胶酶 Y-23 的浓度可以提高消化效率。

在前期条件摸索时，可以先确立以纤维素酶 R-10、果胶酶 Y-23 为基础酶解液配方，根据出现的实验情况来对酶解液进行优化，以下是详细说明：

(旁白：福利来啦，小欧首次公开酶解液的配方哦，绝对的史无前例呀。)

独家配方

1、确定基础酶解液配方（添加量需要通过终浓度结合使用的具体品牌的试剂信息进行计算）：

2、取材筛选：叶片组织取材时优先选取颜色为鲜绿色且叶片较为柔软的部分进行实验（如下图所示）；

根部组织取材优先选取状态饱满、水嫩的根部进行实验；茎部组织取材时需要注意剥去有韧性的外表皮后进行实验。实验摸索前期组织量要尽可能的多，推荐鲜重 0.25-2 g 的组织进行酶解实验。

水稻节间剥去外表皮后效果图

水稻黄化叶片解离摸索使用组织图

3、酶解消化：酶解的过程实质就是通过物理方法使植物组织有足够的切口暴露在酶解液中，通过酶解液分解细胞壁继而使原生质体游离于切口处，然后通过摇床等温和振荡的方法帮助已经无壁的原生质体从切口处游离至酶解液中，最后通过富集纯化得到高质量的原生质体悬液。

实验过程中常见的 FAQ

Q1: 酶解得到的原生质体活率低有哪些原因？要如何避免这种现象？

A1: 酶解得到原生质体活率低可以分为以下几个方向：

1. 酶解 30 min-1 h 镜检原生质体活率低。首先要检查酶解液的 PH 是否低于 5.5，酶解液 PH 较低会影响原生质体状态；其次检查酶解过程中是否进行了避光措施，不采取避光措施会对原生质体质膜造成伤害从而导致活性降低。

2. 酶解时间超过某一时间后活率出现下降，这种情况是因为酶解时间过长导致的原生质体活率下降。

上图为 PH 试纸检测酶解液 PH

Q2: 酶解原生质体得率很低是什么原因造成的？

A2: 原生质体得率低最大可能是酶解液未能很好的接触切口，比如水稻叶片组织，本身不易浸入酶解液中，可以通过真空泵辅助的方法使酶解液进入组织内部，从而提高原生质体得率；还有可能是原生质体没能很好的从切口处游离出去，可以使用更高转速的摇床来辅助原生质体释放，或者通过对酶解后组织的轻微挤压来帮助原生质体释放。

叶片浸润于酶解液中   

真空泵辅助叶片浸入酶解液

Q3: 如何降低原生质体悬液中的碎片占比？

A3: 目前虽可以通过梯度离心的方法对原生质体悬液进行纯化，但这种方法的得率低，需要大量的原生质体来支撑，因此降低碎片最好的方法是优化取材部位，可以通过剥去外表皮、弃去状态不好的组织(失水组织、被挤压后的组织、质地坚硬的组织)、使用锋利的刀片划切组织代替剪刀处理组织来减少碎片的投入量，也更能保障原生质体的活率。

今天的分享就到这里了，关于植物原生质体解离还有很大的进步空间，小欧也在努力探索完善中，希望能够和大家一起攻坚克难！