Theranostics | 湖南师范大学刘中华教授团队开发了一种可预防龋齿的新型抗菌肽

2022-06-30 19:25:11, 欧易生物上海欧易生物医学科技有限公司

前言

龋齿（蛀牙）是最普遍的口腔疾病，严重危害人类公共健康，治疗费用昂贵。龋齿是细菌生物膜引起的常见疾病。目前临床防治药物往往会对口腔微生物多样性和正常组织产生不良影响，主要原因是药物的生物膜靶向性较差。因此，开发高效破坏致龋细菌生物膜的抗菌剂对龋齿的防治尤为迫切和重要。

近日，湖南师范大学工程实验室张鹏博士后、刘中华教授和南开大学余志林研究员为共同通讯作者，在 Theranostics 期刊（IF:11.556）发表了题为“Dual-sensitive antibacterial peptide nanoparticles prevent dental caries”的研究论文，报道了一种pH和脂质双敏感性抗菌肽纳米粒子pHly-1 NPs用于龋齿的防治。

研究结果

1、 pHly-1依赖于pH和脂质进行构象转变

首先通过氨基酸替换策略，选择性的引入组氨酸作为pH敏感元件、调整多肽的电荷以及疏水性，设计pHly-1肽，随后对pHly-1的电位、形态和二级结构进行了表征。在正常生理条件下，pHly-1采用β-折叠构象。在酸性环境下，pHly-1呈无规则卷曲构象，当与脂质双分子层结合时，pHly-1肽的构象由无规则卷曲构象变换为α-螺旋。多肽的TEM形貌表明，在酸性条件下多肽为大小约40 nm的球形颗粒，而在中性条件下则为长度约400 nm的纤维。

图1｜pHly-1设计及其pH或脂质响应构象

2、pHly-1显示pH和脂质双敏感的抗菌活性

变形链球菌UA159（S. mutans）的最低抑制浓度（MICs）检测和溶血实验测定结果显示，pHly-1 NPs抗菌活性高，且溶血活性小（图2A-B）。在pH 5.5和7.0时，pHly-1 NPs 的MIC值分别为5.5 μM和大于44 μM。杀菌动力学表明，pHly-1 NPs杀菌迅速，且具有pH依赖性，效果优于CHX（口服抗菌治疗金标准）（图2C-D）。

表明了pHly-1是一种pH敏感的抗菌肽，在酸性条件下具有强而快速的杀菌活性。其发挥双敏感的潜在机制如图2E所示：在酸性pH环境下，当pHly-1与细菌膜表面结合时，构象由无规则卷曲转变为α-螺旋，导致膜破坏从而表现出较强的抗菌活性。相反，在中性环境下，pHly-1呈β-折叠构象，彼此间通过多种弱相互作用力而发生堆积，限制了多肽对细菌细胞膜的作用，因此抗菌活性较低。

图2｜pHly-1抗菌活性的机制

3、pHly-1 NPs抗菌活性的机理分析

直接破坏细菌膜是大多数抗菌肽杀灭细菌最常见的机制。该研究，通过SEM细菌形态观察和荧光双染研究，证实pHly-1 NPs在pH4.5酸性条件下具有破坏S. mutans细菌膜的作用，表现出杀菌作用（图3A-B）。转录组学数据进一步显示，pHly-1 NPs处理S. mutans后，引起195个基因差异表达（DEGs）。功能富集分析显示，主要涉及蛋白质折叠、细胞程序性死亡、细胞溶解、转录调控等与在细菌的生存和生长相关条目（图3C）。

此外，pHly-1 NPs处理导致了细胞溶解调控基因的表达增加，糖代谢、核酸代谢和DNA复制的基因表达降低（图3D）。除了破坏细菌膜外，与抗菌活性和群体感应相关基因表达下调，群体感应相关基因基因与细菌生物膜发育过程中细菌增殖和群体行为调节有关（图3D）。该结果也为解释了pHly-1 NPs抑制细菌生物膜形成和发展奠定了一定基础。

图3｜不同pH条件下，pHly-1 NPs或CHX处理细菌后的显微研究、荧光染色和转录组分析

4、pHly-1 NPs体外抑制S. mutans生物膜的形成和发展

该研究首先测定了pHly-1 NPs对细菌粘附的影响，实验表明其能抑制了生物膜形成初期的细菌附着。为了进一步评估pHly-1 NPs对预形成生物膜发展的抑制效果，首先让S.mutans在载玻片上逐渐形成生物膜，12小时后，用55 μM pHly-1 NPs或CHX，在不同的pH下，处理生物膜10 min，每天一次共计处理3次。随后采用SEM和共聚焦显微镜对生物膜进行成像，图A中蓝色箭头以及图B中的绿色荧光代表着S.mutans，而红色箭头以及红色荧光则代表着形成的EPS基质。

实验表明在pH 4.5下，pHly-1 NPs处理组中的生物膜团簇、细菌数量和EPS基质密度显著低于对照组（图4A-B）。然而，在对照组、pH 7 条件下的pHly-1 NPs和CHX处理组之间没有观察到显著变化（图4A-B）。以上数据表明，pHly-1 NPs可能以pH依赖性的方式抑制S.mutans生物膜的形成和发展。

图4｜体外酸性条件下pHly-1 NPs对细菌生物膜形成和发展的抑制作用

5、pHly-1 NPs体内和体外的龋齿抑制作用

基于唾液包被的羟基磷灰石(sHA)的生物膜形成实验，作者首先观察到，pHly-1 NPs处理显著减少了sHA表面细菌生物膜的数量和大小，将形成的生物膜超声、匀浆，利用CFU计数法统计各处理组细菌的活力，表明pHly-1 NPs和CHX均能显著抑制生物膜的形成与发展（图5A-B）。

随后收集患有严重龋齿儿童的牙菌斑生物膜样本，分离变形链球菌，建立ex vivo生物膜模型，进一步测试pHly-1 NPs对龋齿生物膜的抑制效果。实验表明在pHly-1 NPs处理组中对形成的细菌生物膜网络具有显著的抑制作用（图5C-D）。上述实验表明了在酸性条件下，pHly-1 NPs显著抑制了体外生物膜的形成与发展。

图5｜pHly-1 NPs体外的龋齿抑制作用

作者基于变形链球菌感染幼鼠牙齿的大鼠模型的体外实验，发现pHly-1 NPs治疗对初始、中度和重度病变的均能有效缓解。但CHX治疗仅缓解严重的病变，对于初始和中度病变的治疗效果显著低于pHly-1 NPs，说明pHly-1 NPs的治疗效果优于CHX，并且对大鼠具有良好的生物安全性（图6）。同时，细胞和类器官等毒性实验也证实了，pHly-1 NPs对胃组织毒性较低，有效预防已报道的龋齿防治纳米颗粒对胃组织造成的潜在损伤。

图6｜pHly-1 NPs体内的龋齿抑制作用

6、pHly-1 NPs对口腔菌群及周围组织的不良影响分析

为了评估pHly-1 NPs和CHX应用于漱口水的临床安全性，将0.2 %的pHly-1 NPs或CHX处理后的小鼠唾液进行微生物组分析。pHly-1 NPs对门水平和属水平的菌群组成并无影响（图7A-C），与对照组结果更为相似（图7D)，且不改变口腔微生物的多样性（图7E-F），表明pHly-1 NPs没有破坏微生物群的生态平衡。此外，H&E染色显示pHly-1 NPs对小鼠牙龈、腭和胃组织没有明显的有害影响（图7G），不良反应仅发生在CHX治疗组。