项目文章 | 从鼻腔到法氏囊，IBDV 感染鸡法氏囊的单细胞测序机制研究

前 言 

2021年12月，南京农业大学动物医学学院杨倩教授及生命科学学院林建副教授，于Cell＆Bioscience(IF:7.133) 在线发表了IBDV 感染鸡法氏囊的单细胞测序的最新研究成果。研究工作内容的主要承担者为Abid Ullah Shah博士。

该研究从鸡传染性法氏囊病毒的鼻腔感染入手，发现和鉴定了IBDV通过鼻腔内部区域（嗅细胞区域）感染鸡，然后转移到血液中传播到法氏囊。其次该研究对2周龄和3周龄及对照组鸡感染IBDV不同时间点的法氏囊样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），构建了IBDV感染鸡法氏囊的单细胞测序图谱，探索了IBDV感染后鸡法氏囊中B细胞库和免疫反应的分子机制。最后，发现法氏囊中的基底细胞是IBDV感染和复制的主要靶细胞。

此外，作者发现Dicer及其相关酶Ago2 和Exportin5 的表达被IBDV 复制大大阻断，表明家禽的RNAi可能是家禽防御RNA 病毒的主要工具。该研究一方面全面阐述了IBDV 通过鸡鼻腔传播至法氏囊的传播途径及病毒感染主要靶细胞；另一方面，研究初步阐明家禽细胞应用RNAi抵抗IBDV的分子机制，为高效防控家禽RNA病毒奠定理论基础。

研究背景 

鸡作为重要的食用动物和模式生物，非常容易被多种RNA病毒（禽流感病毒，传支病毒，法氏囊病毒等）感染。这些病毒都可以通过鸡的鼻腔入侵和感染。为了确定家禽RNA病毒的通过家禽鼻腔入侵的具体位点和细胞，并初步阐明鸡对RNA病毒易感的分子机制。本项目选取传染性法氏囊病病毒（IBDV）来研究家禽RNA病毒通过鼻腔感染和传播分子机制。项目一方面初步阐明了IBDV是如何从鸡的鼻腔转移到鸡尾部的法氏囊；另一方面通过单细胞测序技术深度解析了鸡法氏囊中的细胞亚群及这些细胞感染IBDV后的变化。

基本信息 

文章标题：From nasal to basal: single-cell sequencing of the bursa of Fabricius highlights the IBDV infection mechanism in chickens

影响因子：7.133

发表时间：2021年12月

研究材料：2周龄和3周龄及对照组各20只SPF鸡感染IBDV不同时间点的鼻、法氏囊(BF)和血液样品。

研究方法：高通量单细胞转录组测序（10x Genoimics单细胞转录组测序由欧易生物提供技术支持）

研究结果 

1.鼻内接种IBDV感染鸡鼻上皮细胞

作者用 IBDV 毒株 (BC6/85) 感染鸡，并在感染后72小时从不同器官收集样本。RT-qPCR结果表明通过鼻腔接种感染导致法氏囊中的滴度高于口服给药途径（图 1a）。为了进一步检测 IBDV 感染后鸡鼻腔中的细胞趋向性，将鸡鼻内接种 IBDV 并分为四组，然后选择具有相同间隔的两个CS来显示鸡鼻腔的详细解剖结构（图1b）。进一步的HE染色及IHC染色结果显示IBDV感染并穿过鸡鼻腔的内部横截面（CS-II），它可以从那里转移到血液中或通过肠道途径运输。然而，IBDV并未严重影响NALT（鼻淋巴细胞）（图1c-d）。

图1 鸡鼻腔解剖及IBDV感染细胞的鉴定

2. IBDV在鸡血和PBMC中的复制和分布

为了探究病毒从法氏囊中复制后，进入血流的复制及分布情况，在鼻内接种 IBDV 后 1 hpi、6 hpi 和 24 hpi 分析了血液和外周血单核细胞 (PBMC)。IBDV 信使 RNA（mRNA）在 24 hpi 时在血液和PBMC 中高度积累（图 2a）。进一步地荧光激活细胞分选 (FACS) 分析显示，与未感染的对照鸡群相比，1 hpi 和 6 hpi 时 B 细胞数量增加，6 hpi后发生IgM+ B细胞丢失（图2b-d）。

图2 IBDV 在鸡血和 PBMC 上的复制和分布

3. IBDV在鸡法氏囊中的感染和复制

由于BF是IBDV感染的主要靶器官，随后用IBDV在鼻内给药，并在不同时间点收集法氏囊样本进行分析。IBDV在 36 hpi 后观察到峰值水平，伴随着片段 A 和 B的高水平（图 3a）。进一步地，IHC 染色结果表明 IBDV 片段（片段 A 或 B）在 12 hpi 时几乎没有表达，而两个片段的表达在36 hpi时达到峰值（图 3a、b、d）。并且免疫荧光测定（IFA）结果显示在两周和三周大的小鸡中都有一些双阳性（VP2 阳性和 Bu1 阳性）细胞，且囊泡间隙中的许多Bu1阳性细胞对VP2均呈阴性（图 3c）。

图3 IBDV在鸡法氏囊上的复制和分布

4. 通过宿主和病毒转录组的scRNA-seq构建法氏囊细胞图谱

为了探究法氏囊滤泡间隙中B细胞以外的哪些其他细胞也可能是IBDV感染的目标，作者对对照和 IBDV 感染组的整个法氏囊细胞的 单细胞RNA-seq。首先将所有样品中的法氏囊分为对照和病毒感染组（图 4a、b）。总共获得了 42484 个单转录组，并根据细胞中的差异表达水平进一步分布到九个不同的簇中（图 4c、d 和附加文件 10），并且将这些细胞分为五个簇：两个非免疫细胞类型簇和三个免疫细胞类型簇（图 4e-f）。随后的 FACS 分析证实了这些群体的存在（图 4g）。除B细胞群外，2周龄和3周龄组CD45阳性细胞（造血细胞/白细胞）比例均下降，而CD4+T细胞比例均增加（图4g-h）。

图4 通过单细胞 RNA 测序鉴定的 IBDV 感染的综合法氏囊图

5. 鸡法氏囊B细胞的注释

B细胞是IBDV在法氏囊中靶向的主要细胞，并构成最大的细胞群。作者首先观察了 IBDV 对法氏囊 B 细胞群的影响。数据集中的 B 细胞根据不同的表面标记表达被分为五个不同的簇，其中簇 1、2 和 3 占从对照组分离的B细胞总数的 90% 以上，而从 IBDV 感染组中分离出来的 B 细胞大多被分为簇 4 和 5（图5a、b、c、e）。然后检查了 IBDV 感染后法氏囊中的 B 细胞免疫球蛋白 (Ig) 库，结果表明 IgM 在所有 B 细胞群中均有表达；相比之下，IgY 和 IgA 在簇4中含量丰富，表明这两种 Ig 亚型仅由受感染的法氏囊B细胞群分泌（图 5d），而IBDV 基因组序列仅在簇 4 和簇 5 中观察到（图 5f）。此外，流式细胞术结果与scRNA-seq 结果相一致（图 5g）。磁激活细胞分选 (MACS) 分离的 B 细胞的 qPCR 评估显示在法氏囊中的 IgY+ B细胞中具有高 IBDV 复制（图 5h）。

图5 法氏囊中 B 细胞分布和 FACS 验证了 IBDV 感染后法氏囊 B 细胞亚型的变化

6. 法氏囊上皮细胞的注释

根据基因表达模式将法氏囊上皮细胞分为九个亚群，基于高表达表面标志物的进一步鉴定导致该群体组织成五种不同的上皮下细胞类型（离子细胞、杯状细胞、基底细胞、AT1 细胞和 AT2细胞）（图 6a-d）。进一步分析发现，大多数IBDV基因组序列在法氏囊基底细胞中有大量积累，而一小部分IBDV基因组序列在法氏囊离子细胞和杯状细胞中发现（图6e-f）。进一步的结果表明，除了 B 细胞群外，IBDV 在法氏囊上皮的基底细胞中最为普遍。此外，KRT5 促进整个法氏囊中的病毒复制和分布（图6g-h）。

图6 法氏囊细胞群中的上皮细胞分布和上皮细胞亚型中的IBDV分布

7. 鸡对IBDV感染的干扰素反应

作为重要的抗病毒因子和先天免疫的参与者，禽类中的 I 型干扰素（IFN-α 和 IFN-β）在对抗病毒感染方面发挥着关键作用，且 II 型干扰素 (IFN-γ) 在鸟类和哺乳动物中充当先天免疫和适应性免疫之间的桥梁。因此，作者在体外和体内检测了IBDV感染后的 IFN 反应。体内的单细胞RNA-seq结果显示I型IFN不是鸡中IBDV感染的抗病毒防御途径（图7a-d）。为了验证禽干扰素具有防御病毒复制的功能这一假设，作者进一步的结果表明IBDV可以调节和阻断禽细胞中的IFN系统（图7e-i）。

图7 IBDV感染鸡干扰素通路的表达

8. Dicer在对抗 IBDV 感染的抗病毒防御机制中发挥重要作用

除了干扰素系统，RNAi 是宿主酶Dicer酶识别的有效抗病毒机制，鸡同时具有干扰素和RNAi系统。为了探究Dicer是单独激活 RNAi 机制还是与 Ago和 XPO5协同以防御 IBDV 感染，或是仅在 microRNA 生物发生中起作用，作者用IBDV感染DF1细胞，结果表明细胞中的miRNA发生变化（图8a-b）。对鸡法氏囊中进行的细胞RNA-seq，发现整个细胞群中 Dicer、Drosha、XPO5 和 Ago1基因中的大部分在B细胞群中表达；另外，在对照组中，除T细胞群外，dicer及其相关基因均高度表达。这些结果提示Dicer酶可能会切割IBDV基因组并有助于抗病毒防御机制（图8c-e）。

图8 IBDV感染鸡Dicer/Ago/Exportin5通路的表达

文章总结 

该研究从鸡传染性法氏囊病毒的鼻腔感染入手，一方面全面阐述了IBDV 通过鸡鼻腔传播至法氏囊的传播途径及病毒感染主要靶细胞；另一方面，研究初步阐明家禽细胞应用RNAi抵抗IBDV的分子机制，为高效防控家禽RNA病毒奠定理论基础。

图9 本文的主要结论示意图

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