【应用分享】高色素高油脂终极之王——中药补骨脂的33种农残测定分析

2022-06-16 15:19:46

背景

补骨脂又名黑故子、破故纸，为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实。据报道，补骨脂含挥发油约20％、还含有碱溶性树脂、不挥发性萜类油、有机酸、香豆素、黄酮和皂苷等成分。

近期很多中药检测企业反馈补骨脂中药农残测定非常难做，GCMSMS分析中化合物干扰大且色谱柱污染较为严重极易造成目标物丢峰，同样LCMSMS分析中也有个别化合物干扰导致的丢峰，常规的固相萃取法一、固相萃取法二、固相萃取法三都无法解决。

针对以上含重色素、挥发油和树脂的样品分析存在的问题，纳谱分析优化了HLB产品对于挥发油和树脂的吸附能力。相比常规固相萃取产品，优化后的HLB柱可以吸附更多色素、挥发油、树脂类成分，从而降低了样品中色素对色谱柱的污染和树脂挥发油类照成丢峰拖尾的基质效应，有效的提高了补骨脂样品分析时仪器的灵敏度。

今天，我们一起来看看补骨脂项目的前处理效果吧。

适用范围

本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法2，前处理方法做了部分调整，适用于含有挥发油类基质干扰大和色素较多的中药材农残检测。

实验步骤

一

对照品溶液的制备

1.1 混合对照品配制

精密量取禁用农药混合1mL，置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；

1 .2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1mL含1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1mL含0.1μg的溶液。

1.3 空白基质溶液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

1.4 基质混合对照溶液的制备

分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份），置氮吹仪上，40°C 水浴浓缩至约0.6mL，分别加入混合对照品溶液l0μL、20 μL、50 μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀释至1mL，涡旋混匀，即得。

二

供试品溶液的制备

2.1 提取

精密称取5g样品（3号筛），加氯化钠1g，加入50mL乙腈，匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加50mL乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5mL，加乙腈定容至10mL，摇匀，置-20℃冷藏3h或家用冰箱冷藏过夜，取出趁冷离心，分取所有上清液置离心管中，摇匀，待净化。

三

净化

GCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL
净化：取SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL小柱，加乙腈5mL活化，再取补骨脂提取液2mL置已活化的SelectCore HLB-C固相萃取柱中，收集样品液，待所有样品液进入柱体填料后，取5mL乙腈洗脱，合并样品液与洗脱液，氮吹至2mL即得。
GC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱氮吹定容后的溶液1mL，氮吹至0.4mL加入混合对照溶液，乙腈定容至1mL，再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过0.22μm尼龙针式过滤器，上机分析。
注意事项：样品洗脱定容后只有2mL，故需要配置6个浓度点标准曲线时可合并5次分别5根SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL小柱净化的样品液与洗脱液，40℃以下减压回收至5mL，转移至10mL容量瓶，再取适量乙腈冲洗减压回收瓶并入样品液，定容至10mL。如若做快速样品筛查时可直接将净化的样品液与洗脱液并入10mL已校准的刻度具塞试管中氮吹至2mL即得。

LCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL; 30/pkg
净化：量取补骨脂提取液3mL，过SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL，收集全部净化液，混匀，即得。
LC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后溶液1mL氮吹至0.4ml加入混合对照品液，乙腈定容至1mL，再加入0.3 mL水，混匀，过0.22μm尼龙针式过滤器，上机分析。

四

处理后溶液的颜色比对

GCMSMS样品：

从左至右分别是补骨脂提取液、补骨脂提取液过常规固3 SPE柱、补骨脂提取液过SelectCore HLB-C固相萃取柱500mg/6mL

LCMSMS样品：

从左至右分别是补骨脂提取液、补骨脂提取液过常规固2 SPE柱、补骨脂提取液过SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL

五

气相色谱-串联质谱法

（岛津 GC-MS -TQ8040 NX）

色谱条件

色谱柱：SHIMADZU SH-Rxi-17Sil MS，30m×0.25mm, 0.25μm;
进样口温度：250℃；
升温程序：初始温度为60℃，保持1min；以10℃/min升温至160℃；再以2℃/min升温至230℃，最后以15℃/min升温至300℃，保持6min；
载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；
进样方式：不分流进样；
恒压模式：146kPa；
进样量：1μL。

质谱条件

电离方式：电子轰击电离源（EI）；
电离能量：70Ev；
接口温度：250℃；
离子源温度：250℃；
监测方式：多反应检测模式（MRM）；
溶剂延迟：10.0min。

补骨脂GCB/NH2柱与HLB-C柱净化的CGMSMS数据分析图

普通固3净化方式（TIC图）

HLB-C净化（TIC图）

对硫磷（左边为固3净化样品，右边为HLB-C净化样品）

甲基对硫磷（左边为固3净化样品，右边为HLB-C净化样品）

OP-三氯杀螨醇（左边为固3净化样品，右边为HLB-C净化样品）

PP-三氯杀螨醇（左边为固3净化样品，右边为HLB-C净化样品）

苯线磷（左边为固3净化样品，右边为HLB-C净化样品）

α-硫丹（左边为固3净化样品，右边为HLB-C净化样品）

GCMSMS监测目标物注意事项：

挥发油类基质中：氟虫腈类化合物偶见漂移、可采取LCMSMS监测提高实验效率。
补骨脂基质中氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈亚砜、内吸磷、甲基异柳磷、久效磷、水胺硫磷采用LCMSMS监测结果，GCMSMS可不监测以上化合物。
甲基对硫磷药典配套参考离子对响应低可选用：125.0>47.0 CE:10作为参考离子对，响应较高。
α-硫丹定量离子为：240.80>205.60 参考离子为：194.80>159.00
除草醚定量离子为：282.80>253.00 参考离子为：282.80>201.80
对硫磷定量离子为：139.00>109.00 参考离子为：291.00>81.00

六

高效液相色谱-串联质谱法

（岛津 LC-MS 8045）

色谱条件

色谱柱：ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100 mm，2.6 μm)
流动相：
A：0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）
B：乙腈-0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）=95:5
梯度：

时间（min）	流速（mL/min）	流动相A （%）	流动相B （%）
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
12	0.3	0	100
14	0.3	0	100
14.1	0.3	70	30
16	0.3	70	30

流速: 0.3mL/min
柱温: 40℃
进样量: 2µL

质谱条件

离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描
监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）
离子源接口电压：4.5kV
雾化气：氮气3.0L/min
加热气：干燥空气10.0L/min
DL温度：250℃
加热模块温度：400℃
接口温度：300℃
干燥气：N₂ 10L/min

补骨脂常规HLB柱与SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL净化的LCMSMS数据分析图

苯线磷砜（左边为常规HLB净化样品，右边为SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL净化样品）

治螟磷（左边为常规HLB净化样品，右边为SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL净化样品）

特丁硫磷砜（左边为常规HLB净化样品，右边为SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL净化样品）

水胺硫磷（左边为常规HLB净化样品，右边为SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL净化样品）

补骨脂基质加标LCMSMS氟虫腈类的出峰情况

氟虫腈

氟甲腈

氟虫腈砜

氟虫腈亚砜

LCMSMS监测目标物注意事项：

目标物	定量离子	CE电压	参考离子	CE电压	msec	保留时间（参考）
氟虫腈	434.90>81.00	15	434.90>249.80	30	5	7.341
氟甲腈	386.90>350.80	10	386.90>281.80	35	5	7.656
氟虫腈砜	450.90>281.80	30	450.90>243.80	66	5	8.093
氟虫腈亚砜	419.10>383.10	10	419.10>262.10	27	5	8.103
水胺硫磷	291.00>231.00	-15	291.00>121.00	-30	5	5.106

以上目标物中氟虫腈类化合物均为负离子模式采集，水胺硫磷为正离子模式采集。
由于分析化合物多，且存在正负离子模式同时采集，为提高仪器灵敏度可采用分段采集模式进行，分段采集可设置测定时间为各目标物保留时间前0.5min开始-目标物保留时间后0.5min结束。
挥发油基质样品自动进样器托盘温度不宜过低，否则个别样品会出现分层，导致分析结果不准确，建议25℃为宜。

七

添加回收率

表1 补骨脂中33种农药残留的的测定添加回收结果（%）

农残成分	回收率	农残成分	回收率
甲胺磷	76.8%	甲磺隆	88.2%
甲基对硫磷	84.5%	氯磺隆	73.5%
对硫磷	102.7%	胺苯磺隆	71.4%
久效磷	102.5%	甲拌磷	81.3%
磷胺	109.5%	甲拌磷砜	86.8%
α-六六六	84.1%	甲拌磷亚砜	88.9%
β-六六六	83.3%	甲基异柳磷	91.7%
γ-六六六	83.9%	内吸磷	85.5%
δ-六六六	83.3%	内吸磷	85.5%
2,4''-滴滴涕	76.6%	克百威	91.7%
4,4''-滴滴滴	83.7%	3-羟基克百威	78.3%
4,4''-滴滴涕	79.2%	涕灭威	87.1%
4,4''-滴滴伊	75.3%	涕灭威砜	103.5%
杀虫脒	80.9%	涕灭威亚砜	91.0%
除草醚	86.6%	灭线磷	83.1%
艾氏剂	77.3%	氯唑磷	101.1%
狄氏剂	76.5%	水胺硫磷	83.6%
苯线磷	70.5%	α-硫丹	88.2%
苯线磷砜	100.9%	β-硫丹	85.0%
苯线磷亚砜	82.3%	硫丹硫酸酯	90.6%
地虫硫磷	83.9%	氟虫腈	91.8%
硫线磷	109.5%	氟虫腈砜	86.7%
蝇毒磷	89.5%	氟虫腈亚砜	98.5%
治螟磷	83.8%	氟甲腈	100.8%
特丁硫磷	87.4%	o,p''-三氯杀螨醇	77.2%
特丁硫磷砜	98.4%	p,p''-三氯杀螨醇	80.2%
特丁硫磷亚砜	88.4%	硫环磷	88.5%
甲基硫环磷	66.5%

八

实验讨论

我们实验室曾用药典推荐的四种前处理方法，无论怎么调整填料的比例，都无法解决补骨脂的基质效应问题，因此我们借鉴了固相萃取3的上样和洗脱方式，发现把HLB填料量增加一倍以后，反而比传统固相萃取3做出的数据还要好，而且不需要用到大量的甲苯溶剂，对人员和环境都比较友好。通过以上实验数据比对，可以看出，增加填料后的SelectCore HLB-C 500mg/6mL中药农残专用固相萃取柱，针对补骨脂中大量色素、挥发油和树脂类成分去除效果良好，且溶液颜色较浅，减少污染气相色谱柱、衬管和离子源的风险，还极大的消除了由于基质效应带来的α-硫丹、苯线磷、甲基对硫磷、对硫磷、三氯杀螨醇等农残成分的拖尾、丢峰、目标物线性不好，回收率差的问题。另外SelectCore HLB 500mg/6mL农残专用固相萃取柱，对补骨脂中树脂、挥发油类成分祛除效果良好，减轻了由于基质中干扰物导致的LCMSMS上样品中目标化合物响应低和苯线磷砜丢峰的问题，极大地减小了对离子源的污染，且目标化合物回收率高而稳定。两款固相萃取柱结合使用可为补骨脂的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供良好的帮助。

中药农残相关实验耗材：

方法类别	推荐产品	货号	适用品种
快速样品处理法（QuEC-hERS）	SelectCore QuEChERS 萃取盐包 6g MgSO4, 1.5g NaOAc; 50/pkg	QS-002	川桐皮、川赤芍、木通、通草、灯心草、白芍、麦冬、泽泻、益智、姜黄、枸杞、大枣等含碳水化合物和少量色素类
	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, 900mg MgSO4, 300mg PSA, 300mg C18, 300mg Silica, 90mg GCB; 50/pkg	Q-15PCSG01
	注意事项：前处理步骤较多，提取效率较为充分，溶液颜色较深，基质标每次只能一个点加入盐包时会放热，注意冰浴降温对杀虫脒有吸附，回收率可能偏低
	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, Pesticide Residue A06(含色素挥发油中药农残Q法); 50/pkg	Q-15A06	木香、厚朴、羌活等含挥发油和色素类
	注意事项：改良后的配方可以吸附更多的色素和挥发油基质
固相萃取方法一	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, 1200mg MgSO4, 300mg PSA, 100mg C18; 50/pkg	Q-15PC04	基质简单，色素较少如：人参、西洋参、茯苓、白芍、山药、隔山撬、浙贝母、麦冬、葛根、粉葛、川赤芍、赤芍、白附片、川木通、桑白皮、三七、黄芪、甘草、天花粉
	注意事项：适用于含有较多有机酸和糖干扰的样品，对磺隆类和杀虫脒化合物吸附较强
固相萃取方法二	SelectCore HLB固相萃取柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLB060-060200-1	北柴胡、陈皮、山楂、大黄、柴胡、当归、党参、地黄、防风、黄芪、桔梗、苦参、益母草、黄精、灵芝、茯苓、大青叶、板蓝根、甘草等含少量色素类
	注意事项：吸附色素能力相比固相1要好，对滴滴滴类化合物吸附力较强故GCMSMS样品分析不适用，多用于LCMSMS样品净化
固相萃取方法二	SelectCore HLB-A中药农残专用柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLBA60-060200-1	千年健、桃仁、苦杏仁、花椒、木香、厚朴、沉香、没药、紫苏叶、金银花、艾叶、蛇床子、丹参、款冬花、乌梅、桑叶、牛蒡子、菟丝子、酸枣仁、火麻仁、羌活、莪术、槟榔、小茴香、枳实、郁金、白头翁、菊花、陈皮、白花蛇舌草、褚实子、化橘红、川防风、当归、马钱子等富含挥发油和色素类气质质测定项目
	注意事项：对磺隆类化合物吸附力强，且对三氯杀螨醇类、滴滴滴类化合物具有一定吸附作用，故LCMSMS样品分析不适用，GCMSMS样品分析需5mL样品上柱净化
固相萃取方法二	SelectCore HLB-B中药农残专用柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLBB60-060200-1	色素较多，挥发油较多如：火麻仁、菟丝子、酸枣仁、羌活、川芎、莪术、蛇床子、紫苏叶、姜黄、干姜、陈皮、枳实、青皮、防风、莱菔子、槟榔、当归、小茴香、豆蔻、黄连、黄柏、虎杖、大黄、马钱子、化橘红、当归
	注意事项：对滴滴滴类化合物具有一定吸附性，适用于LCMSMS样品分析，3mL样品上柱净化
固相萃取方法二	SelectCore HLB固相萃取柱 500mg/6mL; 30/pkg	HLB60-060500-1	含重色素、挥发油和树脂的样品如：补骨脂
	SelectCore HLB-C中药农残专用柱 500mg/6mL; 30/pkg	HLBC60-060500-1
	注意事项：挥发油类基质中：氟虫腈类化合物偶见漂移、可采取LCMSMS监测提高实验效率。补骨脂基质中氟甲腈、氟虫腈、氟虫腈亚砜、内吸磷、甲基异柳磷、久效磷、水胺硫磷采用LCMSMS监测结果，GCMSMS可不监测以上化合物。 LCMSMS监测氟虫腈类化合物均为负离子模式采集，水胺硫磷为正离子模式采集。由于分析化合物多，且存在正负离子模式同时采集，为提高仪器灵敏度可采用分段采集模式进行，分段采集可设置测定时间为各目标物保留时间前0.5min开始-目标物保留时间后0.5min结束。挥发油基质样品自动进样器托盘温度不宜过低，否则个别样品会出现分层，导致分析结果不准确，建议25℃为宜。
固相萃取方法三	SelectCore GCB/NH₂-II 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL; 30/pkg	GN100-061000-2	色素含量多，含少量挥发油如：金银花、菊花、款冬花、忍冬花、益母草、淫羊藿、龙胆草、大黄、虎杖、何首乌、麻黄、苦丁茶、刘寄奴、山银花、忍冬藤、川牛膝、地黄、桑叶
	注意事项：洗脱液中有甲苯，毒性较大，且洗脱时间较长；对磺隆类农药有一定吸附LCMSMS样品分析时应联合其他净化方式分析磺隆类数据
固相萃取方法三	SelectCore GCB/NH2-A 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL; 30/pkg	GNA100-061000-1	黄连、黄柏、何首乌、干益母草、吴茱萸、虎杖、大黄、决明子、胡黄连、苕叶细辛、菊花、千里光、蒲公英、艾叶、荆芥、茵陈、金银花、番泻叶、龙胆草、蛇床子、川乌、草乌、车前子、地耳草、金钱草、薄荷、广藿香、老鹳草、紫苏叶、忍冬藤、栀子、连翘、莲子心、竹叶柴胡、矮地茶、红景天、麻黄、白鲜皮、赶黄草、款冬花等
	注意事项：适用于干扰较为严重的GCMSMS样品分析。如若用于LCMSMS样品分析，应联合其他净化方式
液相色谱柱	ChromCore C18-MS Pesticides 2.6μm, 2.1×100mm		S013-026018-02110S
气相色谱柱	NanoChrom BP-50+MS, 30m×0.25mm×0.25um		G5025-3002