【应用分享】持续优化-中药黄连、黄柏的33种农残测定分析

2022-06-16 15:22:49

背景

近期部分中药检测企业反馈黄连、黄柏含大量色素和生物碱对GCMSMS色谱柱污染较为严重极易造成目标物线性不好、回收率低并且重现性差，常规的固相萃取法一、固相萃取法二、固相萃取法三都不能很好的净化，色谱柱前端污染较为严重，容易导致GCMSMS久效磷和甲基硫环磷丢峰。纳谱分析根据植物色素成分特点，近期又针对以上含色素和生物碱样品分析存在的问题，优化了固相2和固相3产品对于色素的吸附能力。相比常规固相萃取方式，优化后的固相萃取柱可以吸附更多生物碱类成分、鞣质类成分和色素成分，从而降低了样品中色素对色谱柱的污染和基质效应。今天，我们来看看黄连、黄柏项目的前处理效果吧。

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适用范围

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本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法2和固相萃取法3，适用于含有生物碱基质干扰大和色素较多的中药材农残检测。

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实验步骤

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一

对照品溶液的制备

1.1 混合对照品配制

精密量取禁用农药混合1mL，置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；

1 .2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1mL含1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1mL含0.1μg的溶液。

1.3 空白基质溶液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

1.4 基质混合对照溶液的制备

分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份），置氮吹仪上，40°C 水浴浓缩至约0.6mL，分别加入混合对照品溶液l0μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀释至lmL，涡旋混匀，即得。

二

供试品溶液的制备

2.1 提取

精密称取5g样品（3号筛），加氯化钠1g，加入50mL乙腈，匀浆处理2分钟，离心后分取上清液，残渣再加50mL乙腈，匀浆处理1分钟，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5mL，加乙腈定容至10mL，摇匀，待净化。

三

净化

GCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL
净化：量取乙腈：甲苯（3:1）10ml过SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL活化，活化液弃去，精密移取直接提取法制备的样品液2ml置萃取小柱上，待样品液全部过萃取小柱后，加乙腈：甲苯（3:1）20ml洗脱，收集全部洗脱液，40℃以下减压回收至适量转移至已校准过的10ml具刻度离心管内，再用适量乙腈充分洗涤减压回收瓶，洗液并入同一离心管内，氮吹至2ml，混匀，即得。
GC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后减压回收定溶后的溶液1mL，氮吹至0.4ml加入混合对照溶液，乙腈定溶至1ml，再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过PTFE膜，上机分析。
注意事项：固相萃取柱SelectCore GCB/NH₂-A 上层填料粒径较大，运输过程中可能会与上筛板产生一点间隙而导致滴速不均匀，使用前用玻璃棒或者注射器推杆压实就可以了。另外该固相萃取柱中含有的填料会对磺隆类化合物和久效磷产生较大吸附，故LCMSMS样品分析建议用固相2的方法来处理。

LCMSMS样品：

SPE柱：SelectCore HLB-B 固相萃取柱 200mg/6ml
净化：量取直接提取法制备的供试品液3ml，过SelectCore HLB-B中药农残专用固相萃取柱，收集全部净化液，混匀，即得。
LC/MS/MS测定：精密量取过固相萃取柱后溶液1mL氮吹至0.4ml加入混合对照品液，乙腈定溶至1ml，再加入0.3 mL水，混匀，过PTFE膜，上机分析。

四

处理后溶液的颜色比对

GCMSMS样品：

从左至右分别是黄连提取液、黄连提取液过普通固3柱、黄连提取液过SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱

从左至右分别是黄柏提取液、黄柏提取液过普通固3柱、黄柏提取液过SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱

LCMSMS样品：

从左至右分别是黄连提取液、黄连提取液过普通HLB柱、黄连提取液过SelectCore HLB-B 固相萃取柱

从左至右分别是黄柏提取液、黄柏提取液过普通HLB柱、黄柏提取液过SelectCore HLB-B 固相萃取柱

五

气相色谱-串联质谱法

（岛津 GC-MS -TQ8040 NX）

色谱条件

色谱柱：SHIMADZU SH-Rxi-17Sil MS，30m×0.25mm，0.25μmD;
进样口温度：250℃；
升温程序：初始温度为60℃，保持1min；以10℃/min升温至160℃；再以2℃/min升温至230℃，最后以15℃/min升温至300℃，保持6min；
载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；
进样方式：不分流进样；
恒压模式：146kPa；
进样量：1μL。

质谱条件

电离方式：电子轰击电离源（EI）；
电离能量：70Ev；
传输线温度：250℃；
离子源温度：250℃；
监测方式：多反应检测模式（MRM）；
溶剂延迟：10.0min。

GCMSMS数据分析TIC图

普通固3净化方式（黄连TIC图）

GCB/NH2-A 固相萃取柱净化（黄连TIC图）

GCB/NH2-A 固相萃取柱净化（黄柏TIC图）

黄连中久效磷（左）、甲基硫环磷（右）出峰情况

黄柏中久效磷（左）、甲基硫环磷（右）出峰情况

六

高效液相色谱-串联质谱法

（岛津 LC-MS 8045）

色谱条件

色谱柱：ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100 mm，2.6 μm)
流动相：
A：0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）
B：乙腈/0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L 甲酸铵）=95/5
梯度：

时间（min）	流速（mL/min）	流动相A （%）	流动相B （%）
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
12	0.3	0	100
14	0.3	0	100
14.1	0.3	70	30
16	0.3	70	30

流速: 0.3 mL/min
柱温: 40 ℃
进样量: 2 µL

质谱条件

离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描
监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）
离子源接口电压：4.5kV
雾化气：氮气3.0L/min
加热气：干燥空气10.0L/min
DL温度：250℃
加热模块温度：400℃
接口温度：300℃
干燥气：N₂ 10 L/min

七

添加回收率

表1 黄连中33种农药残留的的测定添加回收结果（%）

农残成分	回收率	农残成分	回收率
甲胺磷	74.8%	甲磺隆	93.6%
甲基对硫磷	87.6%	氯磺隆	94.8%
对硫磷	99.8%	胺苯磺隆	89.9%
久效磷	84.5%	甲拌磷	91.7%
磷胺	86.4%	甲拌磷砜	92.9%
α-六六六	89.8%	甲拌磷亚砜	90.6%
β-六六六	93.6%	甲基异柳磷	89.5%
γ-六六六	90.9%	内吸磷-O	94.3%
δ-六六六	76.3%	内吸磷-S	80.1%
2,4''-滴滴涕	91.5%	克百威	90.9%
4,4''-滴滴滴	90.2%	3-羟基克百威	70.2%
4,4''-滴滴涕	87.2%	涕灭威	85%
4,4''-滴滴伊	96.2%	涕灭威砜	71.9%
杀虫脒	86.9%	涕灭威亚砜	85.3%
除草醚	87.3%	灭线磷	85.5%
艾氏剂	94.7%	氯唑磷	92.2%
狄氏剂	96.6%	水胺硫磷	76.3%
苯线磷	91.2%	α-硫丹	87.6%
苯线磷砜	92.7%	β-硫丹	92.3%
苯线磷亚砜	110.0%	硫丹硫酸酯	82.7%
地虫硫磷	88.1%	氟虫腈	90.1%
硫线磷	88.2%	氟虫腈砜	91.1%
蝇毒磷	84.7%	氟虫腈亚砜	91.3%
治螟磷	91.4%	氟甲腈	92.8%
特丁硫磷	92.9%	o,p''-三氯杀螨醇	97.2%
特丁硫磷砜	89.7%	p,p''-三氯杀螨醇	98.8%
特丁硫磷亚砜	88.2%	硫环磷	70.2%
甲基硫环磷	76.7%

表2 黄柏中33种农药残留的的测定添加回收结果（%）

农残成分	回收率	农残成分	回收率
甲胺磷	71.9%	甲磺隆	96.6%
甲基对硫磷	78.5%	氯磺隆	93.1%
对硫磷	75.9%	胺苯磺隆	92.3%
久效磷	71.2%	甲拌磷	87.3%
磷胺	92.4%	甲拌磷砜	97.3%
α-六六六	82.0%	甲拌磷亚砜	94.1%
β-六六六	81.5%	甲基异柳磷	88.2%
γ-六六六	84.3%	内吸磷-O	79.6%
δ-六六六	73.3%	内吸磷-S	87.6%
2,4''-滴滴涕	90.4%	克百威	95.1%
4,4''-滴滴滴	88.9%	3-羟基克百威	81.2%
4,4''-滴滴涕	81.6%	涕灭威	94.2%
4,4''-滴滴伊	85.4%	涕灭威砜	86.0%
杀虫脒	70.2%	涕灭威亚砜	82.2%
除草醚	88.8%	灭线磷	91.1%
艾氏剂	87.2%	氯唑磷	87.1%
狄氏剂	90.3%	水胺硫磷	76.9%
苯线磷	84.3%	α-硫丹	86.4%
苯线磷砜	89.4%	β-硫丹	80.3%
苯线磷亚砜	92.5%	硫丹硫酸酯	79.5%
地虫硫磷	92.1%	氟虫腈	79.2%
硫线磷	89.0%	氟虫腈砜	86.2%
蝇毒磷	84.9%	氟虫腈亚砜	84.5%
治螟磷	84.1%	氟甲腈	82.8%
特丁硫磷	75.3%	o,p''-三氯杀螨醇	81.6%
特丁硫磷砜	91.9%	p,p''-三氯杀螨醇	82.1%
特丁硫磷亚砜	92.4%	硫环磷	107.6%
甲基硫环磷	78.5%

八

实验讨论

通过以上实验数据比对，可以看出，SelectCore GCB/NH₂-A 中药农残专用固相萃取柱，针对黄连、黄柏中大量色素和生物碱类成分去除效果良好，且溶液颜色较浅，减少污染气相色谱柱、衬管和离子源的风险，还极大的消除了由于基质效应带来的硫丹、滴滴滴、六六六等农残成分的回收率偏低、目标物线性不好，回收率重现性差的问题，并且有客户反馈色谱柱前端污染而导致久效磷和甲基硫环磷丢峰的问题也得到了解决。SelectCore HLB-B中药农残专用固相萃取柱，对黄连、黄柏中色素成分祛除效果良好，减轻了由于基质中干扰物导致的LCMSMS上样品中目标化合物响应低的问题，极大地减小了对离子源的污染，且目标化合物回收率高而稳定。两款固相萃取柱为黄连和黄柏的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。

中药农残相关实验耗材：

方法类别	推荐产品	货号	适用品种
快速样品处理法（QuEC-hERS）	SelectCore QuEChERS 萃取盐包 6g MgSO4, 1.5g NaOAc; 50/pkg	QS-002	川桐皮、川赤芍、木通、通草、灯心草、白芍、麦冬、泽泻、益智、姜黄、枸杞、大枣等含碳水化合物和少量色素类
	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, 900mg MgSO4, 300mg PSA, 300mg C18, 300mg Silica, 90mg GCB; 50/pkg	Q-15PCSG01
	注意事项：前处理步骤较多，提取效率较为充分，溶液颜色较深，基质标每次只能一个点加入盐包时会放热，注意冰浴降温对杀虫脒有吸附，回收率可能偏低
	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, Pesticide Residue A06(含色素挥发油中药农残Q法); 50/pkg	Q-15A06	木香、厚朴、羌活等含挥发油和色素类
	注意事项：改良后的配方可以吸附更多的色素和挥发油基质
固相萃取方法一	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, 1200mg MgSO4, 300mg PSA, 100mg C18; 50/pkg	Q-15PC04	基质简单，色素较少如：人参、西洋参、茯苓、白芍、山药、隔山撬、浙贝母、麦冬、葛根、粉葛、川赤芍、赤芍、白附片、川木通、桑白皮、三七、黄芪、甘草、天花粉
	注意事项：适用于含有较多有机酸和糖干扰的样品，对磺隆类和杀虫脒化合物吸附较强
固相萃取方法二	SelectCore HLB固相萃取柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLB060-060200-1	北柴胡、陈皮、山楂、大黄、柴胡、当归、党参、地黄、防风、黄芪、桔梗、苦参、益母草、黄精、灵芝、茯苓、大青叶、板蓝根、甘草等含少量色素类
	注意事项：吸附色素能力相比固相1要好，对滴滴滴类化合物吸附力较强故GCMSMS样品分析不适用，多用于LCMSMS样品净化
固相萃取方法二	SelectCore HLB-A中药农残专用柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLBA60-060200-1	千年健、桃仁、苦杏仁、花椒、木香、厚朴、沉香、没药、紫苏叶、金银花、艾叶、蛇床子、丹参、款冬花、乌梅、桑叶、牛蒡子、菟丝子、酸枣仁、火麻仁、羌活、莪术、槟榔、小茴香、枳实、郁金、白头翁、菊花、陈皮、白花蛇舌草、褚实子、化橘红、川防风、当归、马钱子等富含挥发油和色素类气质质测定项目
	注意事项：对磺隆类化合物吸附力强，且对三氯杀螨醇类、滴滴滴类化合物具有一定吸附作用，故LCMSMS样品分析不适用，GCMSMS样品分析需5mL样品上柱净化
固相萃取方法二	SelectCore HLB-B中药农残专用柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLBB60-060200-1	色素较多，挥发油较多如：火麻仁、菟丝子、酸枣仁、羌活、川芎、莪术、蛇床子、紫苏叶、姜黄、干姜、陈皮、枳实、青皮、防风、莱菔子、槟榔、当归、小茴香、豆蔻、黄连、黄柏、虎杖、大黄、马钱子、化橘红、当归
	注意事项：对滴滴滴类化合物具有一定吸附性，适用于LCMSMS样品分析，3mL样品上柱净化
固相萃取方法三	SelectCore GCB/NH₂-II 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL; 30/pkg	GN100-061000-2	色素含量多，含少量挥发油如：金银花、菊花、款冬花、忍冬花、益母草、淫羊藿、龙胆草、大黄、虎杖、何首乌、麻黄、苦丁茶、刘寄奴、山银花、忍冬藤、川牛膝、地黄、桑叶
	注意事项：洗脱液中有甲苯，毒性较大，且洗脱时间较长；对磺隆类农药有一定吸附LCMSMS样品分析时应联合其他净化方式分析磺隆类数据
固相萃取方法三	SelectCore GCB/NH2-A 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL; 30/pkg	GNA100-061000-1	黄连、黄柏、何首乌、干益母草、吴茱萸、虎杖、大黄、决明子、胡黄连、苕叶细辛、菊花、千里光、蒲公英、艾叶、荆芥、茵陈、金银花、番泻叶、龙胆草、蛇床子、川乌、草乌、车前子、地耳草、金钱草、薄荷、广藿香、老鹳草、紫苏叶、忍冬藤、栀子、连翘、莲子心、竹叶柴胡、矮地茶、红景天、麻黄、白鲜皮、赶黄草、款冬花等
	注意事项：适用于干扰较为严重的GCMSMS样品分析。如若用于LCMSMS样品分析，应联合其他净化方式
液相色谱柱	ChromCore C18-MS Pesticides 2.6μm, 2.1×100mm		S013-026018-02110S
气相色谱柱	NanoChrom BP-50+MS, 30m×0.25mm×0.25um		G5025-3002