【应用分享】中药灵芝中33种禁用农残测定

2022-06-16 15:16:10

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中药灵芝

33种农残测定分析

本品为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。由于灵芝质地松泡，应用直接提取法时匀浆不易将样品完全均质，常见因提取不完全导致回收率偏低，因此针对这个品种我们推荐快速样品处理（QuEChERS）。

今天，我们来看看灵芝项目的前处理效果吧。

适用范围

本方法参考中国药典2020版2341第五法中的QuEChERS法。

实验步骤

一

对照品溶液的制备

1.1 混合对照品配制

精密量取禁用农药混合1mL，置20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；

1 .2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备

取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1mL含1.0mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1mL含0.1μg的溶液。

1.3 空白基质溶液的制备

取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。

1.4 基质混合对照溶液的制备

分别精密量取空白基质溶液1.0mL(6份），置氮吹仪上，40°C 水浴浓缩至约0.6mL，分别加入混合对照品溶液10μL、20 μL、50 μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀释至1mL，涡旋混匀，即得。

二

供试品溶液的制备

粉碎：

先将灵芝药材切成小块或片，使用粉碎机将其粉碎成粉末和絮状物的混合物，再将其转入开刀口的打粉机或破壁打粉机彻底粉碎，过3号筛即得。

QuEChERS 法

提取：

取灵芝粉末（过三号筛）3g，精密称定，置50mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30分钟，精密加入乙腈15mL，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/分）5分钟，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末(4: 1) 7.5g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡（500次/分）3分钟，于冰浴中冷却10分钟，离心（每分钟4000转）5分钟，待净化。取灵芝粉末（过三号筛）3g，精密称定，置50mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30分钟，精密加入乙腈15mL，涡旋使混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/分）5分钟，加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末(4: 1)7.5g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡（500次/分）3分钟，于冰浴中冷却10分钟，离心（每分钟4000转）5分钟，待净化。

附注：

由于灵芝粉末质地松泡，如果选择直接提取法可能匀浆不彻底，导致提取不完全；且第二次加入50mL乙腈后，样品液极易溢出离心管导致结果不准确；故选择QuEChERS法提取较为理想。如使用直接提取法需选择合适的样品量处理，避免出现上述问题。

三

净化

Q法净化管：Q-15PCSG01 SelectCore QuEChERS净化管 15mL, 900mg MgSO4, 300mg PSA, 300mg C18, 300mg Silica, 90mg GCB

净化：取上述提取液上清液9mL置Q-15PCSG01净化管中涡旋使充分混匀，置振荡器上剧烈振荡（500次/分）5分钟使净化完全，离心（每分钟4000转）5分钟，即得。

GC-MS/MS测定：精密吸取上清液5mL，置氮吹仪上于35℃水浴浓缩至约0.4mL，加入混合对照品液再加乙腈稀释至1.0mL，涡旋混匀，再加入0.3mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过0.22μm尼龙针式过滤器，上机分析。

LC-MS/MS测定：精密吸取上清液5mL，置氮吹仪上于35℃水浴浓缩至约0.4mL，加入混合对照品液再加乙腈稀释至1.0mL，涡旋混匀，再加入0.3mL水，混匀，过0.22μm尼龙针式过滤器，上机分析。

四

气相色谱-串联质谱法

（岛津 GC-MS -TQ8040 NX）

色谱条件

色谱柱：SHIMADZU SH-Rxi-17Sil MS，30m×0.25mm, 0.25μm;
进样口温度：250℃；
升温程序：初始温度为60℃，保持1min；以10℃/min升温至160℃；再以2℃/min升温至230℃，最后以15℃/min升温至300℃，保持6min；
载气：高纯氦气（纯度>99.999%）；
进样方式：不分流进样；
恒压模式：146kPa；
进样量：1μL。

质谱条件

电离方式：电子轰击电离源（EI）；
电离能量：70Ev；
接口温度：250℃；
离子源温度：250℃；
监测方式：多反应检测模式（MRM）；
溶剂延迟：10.0min。

四

高效液相色谱-串联质谱法

（岛津 LC-MS 8045）

色谱条件

色谱柱：ChromCore C18-MS Pesticides中药农残专用柱(2.1 ×100mm，2.6μm)
流动相：
A：0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）
B：乙腈-0.1%甲酸水溶液（含有5mmol/L甲酸铵）=95:5
梯度：

时间（min）	流速（mL/min）	流动相A （%）	流动相B （%）
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
12	0.3	0	100
14	0.3	0	100
14.1	0.3	70	30
16	0.3	70	30

流速: 0.3mL/min
柱温: 40℃
进样量: 2µL

质谱条件

离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）正离子扫描
监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）
离子源接口电压：4.5kV
雾化气：氮气3.0L/min
加热气：干燥空气10.0L/min
DL温度：250℃
加热模块温度：400℃
接口温度：300℃
干燥气：N₂ 10L/min

六

实验结果

QuEChERS法处理灵芝基质LOQ浓度点加标谱图

（GC-MS/MS方法）

QuEChERS法处理灵芝基质LOQ浓度点加标谱图

（LC-MS/MS方法）

六

添加回收率

表（1）灵芝中33种农药残留的测定添加回收结果（%）

七

实验讨论

通过以上实验数据可以看出，灵芝使用QuEChERS法提取效果较为理想，搭配Q-15PCSG01净化管净化后的灵芝样品回收率较好，为灵芝的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。

中药农残相关实验耗材：

方法类别	推荐产品	货号	适用品种
快速样品处理法（QuEC-hERS）	SelectCore QuEChERS 萃取盐包 6g MgSO4, 1.5g NaOAc; 50/pkg	QS-002	川桐皮、川赤芍、木通、通草、灯心草、白芍、麦冬、泽泻、益智、姜黄、枸杞、大枣等含碳水化合物和少量色素类
	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, 900mg MgSO4, 300mg PSA, 300mg C18, 300mg Silica, 90mg GCB; 50/pkg	Q-15PCSG01
	注意事项：前处理步骤较多，提取效率较为充分，溶液颜色较深，基质标每次只能一个点加入盐包时会放热，注意冰浴降温对杀虫脒有吸附，回收率可能偏低
	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, Pesticide Residue A06(含色素挥发油中药农残Q法); 50/pkg	Q-15A06	木香、厚朴、羌活等含挥发油和色素类
	注意事项：改良后的配方可以吸附更多的色素和挥发油基质
	SelectCore QuEChERS 净化管15mL, Pesticide Residue A07(丹参中药农残Q法); 50/pkg	Q-15A07	丹参专用
	注意事项：改良后的配方提高了丹参农残测定的稳定性和重现性
固相萃取方法一	SelectCore QuEChERS 净化管 15mL, 1200mg MgSO4, 300mg PSA, 100mg C18; 50/pkg	Q-15PC04	基质简单，色素较少如：人参、西洋参、茯苓、白芍、山药、隔山撬、浙贝母、麦冬、葛根、粉葛、川赤芍、赤芍、白附片、川木通、桑白皮、三七、黄芪、甘草、天花粉
	注意事项：适用于含有较多有机酸和糖干扰的样品，对磺隆类和杀虫脒化合物吸附较强
固相萃取方法二	SelectCore HLB固相萃取柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLB060-060200-1	紫草、北柴胡、陈皮、山楂、大黄、柴胡、当归、党参、地黄、防风、黄芪、桔梗、苦参、益母草、黄精、灵芝、茯苓、大青叶、板蓝根、甘草等含少量色素类
	注意事项：吸附色素能力相比固相1要好，对滴滴滴类化合物吸附力较强故GCMSMS样品分析不适用，多用于LCMSMS样品净化
	SelectCore HLB-A中药农残专用柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLBA60-060200-1	千年健、桃仁、苦杏仁、花椒、没药、紫苏叶、厚朴、金银花、艾叶、款冬花、乌梅、桑叶、牛蒡子、菟丝子、酸枣仁、莪术、槟榔、小茴香、枳实、郁金、白头翁、菊花、陈皮、白花蛇舌草、褚实子、化橘红、川防风、当归等富含挥发油和色素类气质质测定项目
	注意事项：对磺隆类化合物吸附力强，且对三氯杀螨醇类、滴滴滴类化合物具有一定吸附作用，故LCMSMS样品分析不适用，GCMSMS样品分析需5mL样品上柱净化
	SelectCore HLB-B中药农残专用柱 200mg/6mL; 30/pkg	HLBB60-060200-1	色素较多，挥发油较多如：火麻仁、菟丝子、厚朴、酸枣仁、羌活、川芎、莪术、蛇床子、紫苏叶、姜黄、干姜、陈皮、枳实、青皮、防风、莱菔子、槟榔、当归、小茴香、豆蔻、黄连、黄柏、虎杖、大黄、马钱子、化橘红、当归
	注意事项：对滴滴滴类化合物具有一定吸附性，适用于LCMSMS样品分析，3mL样品上柱净化
	SelectCore HLB-C中药农残专用柱 500mg/6mL; 30/pkg	HLBC60-060500-1	血竭、补骨脂、吴茱萸、沉香、没药、蛇床子、火麻仁、小茴香、马钱子等富含挥发油、色素和生物碱类气质质测定项目
	适用于重油重色素和生物碱的果实和种子类中药，GCMSMS样品分析需2mL样品上柱净化
固相萃取方法三	SelectCore GCB/NH₂-II 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL; 30/pkg	GN100-061000-2	色素含量多，含少量挥发油如：金银花、菊花、款冬花、忍冬花、益母草、淫羊藿、龙胆草、大黄、虎杖、何首乌、麻黄、苦丁茶、刘寄奴、山银花、忍冬藤、川牛膝、地黄、桑叶
	注意事项：洗脱液中有甲苯，毒性较大，且洗脱时间较长；对磺隆类农药有一定吸附LCMSMS样品分析时应联合其他净化方式分析磺隆类数据
	SelectCore GCB/NH₂-A 固相萃取柱 500mg/500mg/6mL; 30/pkg	GNA100-061000-1	紫草、黄连、黄柏、何首乌、干益母草、吴茱萸、虎杖、大黄、决明子、胡黄连、苕叶细辛、菊花、千里光、蒲公英、艾叶、荆芥、茵陈、金银花、番泻叶、龙胆草、蛇床子、川乌、草乌、车前子、地耳草、金钱草、薄荷、广藿香、老鹳草、紫苏叶、忍冬藤、栀子、连翘、莲子心、竹叶柴胡、矮地茶、红景天、麻黄、白鲜皮、赶黄草、款冬花等
	注意事项：适用于干扰较为严重的GCMSMS样品分析。如若用于LCMSMS样品分析，应联合其他净化方式
液相色谱柱	ChromCore C18-MS Pesticides 2.6μm, 2.1×100mm		S013-026018-02110S
气相色谱柱	NanoChrom BP-50+MS, 30m×0.25mm×0.25um		G5025-3002