2022-06-10 21:00:59, 孙燕萍,李惠琳等 华质泰科生物技术(北京)有限公司
01
转载自公众号:李惠琳课题组
(文字有少许删减修改)
撰稿:孙燕萍 编辑:李惠琳
李惠琳课题组网址:
www.x-mol.com/groups/li_huilin
文章发表于 Anal. Chem., Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145kDa Directly from Tissue [1],非变性原位质谱直接从组织中分析高达 145 kDa 的完整内源性蛋白质组装体。
文献通讯作者:
Helen J. Cooper 教授,英国伯明翰大学
非变性原位质谱(native ambient mass spectrometry, NAMS)是一种新型的自上而下质谱分析方法。它结合非变性质谱和原位质谱的优势,可直接在蛋白质及其复合物的生理环境中对其进行无标记表征。NAMS 可提供蛋白质结构、空间及瞬时相互作用的信息,具有直接从组织中分析内源性蛋白质组装体的巨大潜力。早前 NAMS 曾成功应用于直接检测达两万 (<20kDa) 的中等分子量生物分子或冗余蛋白,如血红蛋白四聚体或 RidA 同源三聚体。
目前应用于组织中蛋白质 NAMS 分析的技术有液体萃取表面分析(LESA)和纳流解析电喷雾电离(nano-DESI)[2]。LESA 直接对组织底物进行自动微液节点采样,然后进行纳喷雾电离(nanoESI)质谱分析。nano-DESI 则通过喷针与流动相形成流动溶剂桥,与样品喷雾接触,之后进行质谱成像。
在本研究中,作者采用 NAMS (LESA) 对大鼠脑、肾、肝组织切片中的蛋白质组装体进行全面分析。主要通过调整质谱仪的离子化参数改善 m/z 传输与纳喷雾性能,以实现对较大蛋白质组装体的分析。结果鉴定出八种蛋白质组装体,证明了 NAMS(LESA)的可及分子量高达145 kDa;另外,通过 nano-DESI 质谱成像在大脑和肾脏中绘制了达 94 kDa 的蛋白质组装体的空间分布。
在脑组织中,作者通过 nano-DESI 绘制了大鼠大脑切片中分子量为 37.0–66.4 kDa 的完整蛋白质复合物的空间分布以及对应的质谱图(图1a,b)。实验成功鉴定并成像出大鼠脑组织中三种蛋白质组装体,包括同源三聚体细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF, 37.0 kDa)、同源二聚体磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1, 57.6 kDa)和苹果酸脱氢酶2(MDH2, 66.4 kDa)。结果发现,MIF 在整个脑组织区域是均匀分布(图1c)。作者通过 nano-DESI-HCD MS2 分析产生的单体(5+、4+)和二聚体(5+)亚基和序列离子的谱图,识别出 MIF(图1d)。作者还利用 nano-DESI-HCD MS2成功识别出 PGAM1,并发现 PGAM1 在大脑皮层区域中显示出高丰度,而在中脑和胼胝体中的丰度较低(图1e,f)。相比之下,MDH2 在脑组织中的空间分布基本均匀(图1g,h)。检测到的结果与蛋白在大鼠脑中的实际分布相符合,可信度较高。
图1. 离子图像和 HCD MS2光谱表明大鼠脑中蛋白质复合物的亚基解离。(a) H&E 染色的连续组织切片的光学图像。标签:Ce,小脑;C,大脑皮层;CC,胼胝体;F,穹窿;V,侧脑室区;Mb,中脑;Me,髓质和脑桥;H,海马;Th,丘脑;Ht,下丘脑;BG,基底神经节;OR,嗅觉区域。(b) Nano-DESI全扫描质谱,代表光学图像中标记为“(b)”的像素。(c,d)巨噬细胞抑制因子同源三聚体显示均匀分布。(e,f) PGAM1 同型二聚体分布。(g,h )MDH2 同型二聚体分布。
此外,作者在大鼠肾脏中鉴定了四种同源二聚体蛋白组装体(61.2-94.2 kDa),包括ω-酰胺酶(61.2 kDa)、MDH2(66.4 kDa)、苹果酸脱氢酶1(MDH1, 72.8 kDa)和 α-烯醇化酶(94.2 kDa),并将其成像(图2)。其中观察到的 α-烯醇化酶为金属结合形式,每个亚基上结合了2个 Mg2+离子。
图2. (a)大鼠肾脏的 H&E 染色连续切片显示皮质(C)和髓质(M)组织。(b)在 MSI 期间获得的大鼠肾皮质组织中单个 nano-DESI 像素的示例全扫描质谱。(c, d) α-烯醇化酶同型二聚体。(e, f)苹果酸脱氢酶1。(g, h) MDH2 同型二聚体。(i, j) ω-酰胺酶。
研究还从大鼠肝组织中鉴定出同型三聚体鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC, 108.8 kDa)和同型四聚体乳酸脱氢酶 A(LDHA, 145.4 kDa)(图3)。其中,在全扫描模式下,nano-DESI 可以检测到 145.4 kDa 的 LDHA 的较弱信号。通过 nano-DESI-PTCRMS2 的进一步确认,检测到的物质确实为 LDHA。
图3. (a)直接来自大鼠肝组织的完整 OTC 同源三聚体的 nano-DESI-PTCR MS2。(b)完整 OTC 同源三聚体的 nano-DESI-HCDMS2显示亚基质量为36.2 kDa。(c)完整 LDHA同源四聚体(145.4 kDa)的 nanoESI-PTCR MS2。(d)完整 LDHA 同源四聚体的 nanoESI-HCD MS2。
在此研究中,作者成功利用 NAMS 质谱分析方法,直接从组织中检测并鉴定出内源性蛋白质组装体,分子范围为37.0-145.4 kDa,包括二聚体、三聚体以及四聚体。其中,本文中 LESA NAMS 的分子量检测上限,即14.5万 (145.4 kDa),达到早前报道的传统 LESA 方法的两倍以上;本文的 nano-DESI NAMS 更比早前报道的传统 nano-DESI 方法高出了十万 (100 kDa)。通过调整离子光学和高 m/z 的气体压力,或者后续仪器和方法的开发,NAMS 有望进一步突破 145.4 kDa 的上限,检测到分子量更大的蛋白组装体。
02
Liquid extraction surface analysis for native mass spectrometry: Protein complexes and ligand binding
非变性 LESA-MS:蛋白质复合物和配体结合
Helen J. Cooper 教授2016年研究成果[3]
非变性液滴萃取表面分析(LESA)质谱能够从固体表面直接取样蛋白质复合物。早期研究已证明了非变性 LESA-MS 提取检测载玻片上的全肌红蛋白(∼17 kDa)、干血斑和薄组织切片中的四聚血红蛋白(∼64 kDa)。
在此,通过研究体内以各种寡聚状态存在的一系列蛋白质,进一步探索 LESA-MS 的能力。亲和素四聚体(∼64 kDa),CS2水解酶八聚体(∼190 kDa)和十六聚体(∼380 kDa)和 GroEL 十四聚体 (高达∼800 kDa)均通过非变性LESA-MS 检测到。此外,也可以观察到膜蛋白三聚体 AmtB。研究了 LESA-MS 用于探测蛋白质-配体结合的适用性,并检测到配体生物素和蛋白质亲和素、血红蛋白和牛血清白蛋白的非共价复合物。结果表明,非特异性结合很少,非变性 LESA-MS 是研究具有生物学意义的配体结合的一种很有前景和潜力的工具。
载玻片上蛋白质复合物的非变性 LESA-MS。
总之,非变性 LESA-MS:(1)适用于高质量蛋白质复合物的分析;(2)探询可溶性蛋白和膜蛋白的复合物;(3)探索蛋白质-配体相互作用。通过 LESA 与更高分辨和更高质量扫描范围的质谱仪连接,可进一步提升蛋白质复合物的分子量检测上限。
未来非变性 LESA-MS 可进一步扩展到蛋白质/配体结合分析、仿生膜膜蛋白复合物分析以及非均质生物表面(如干血点和组织切片)的原位分析。
● 参考文献:
[1] Hale OJ, Hughes JW, Sisley EK, Cooper HJ. Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue. Anal Chem. 2022 Apr12;94(14):5608-5614.
[2] Hale OJ, Cooper HJ. Native Mass Spectrometry Imagingand In Situ Top-Down Identification of Intact Proteins Directly from Tissue. J Am Soc Mass Spectrom. 2020 Dec 2;31(12):2531-2537.
[3] Victor A. Mikhailov, Rian L. Griffiths, Helen J. Cooper. Liquid extraction surface analysis for native mass spectrometry: Protein complexes and ligand binding. International Journal of Mass Spectrometry. 420 (2017) 43–50
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