染料探针｜靶向 EGFR 的 NIR-II 染料纳米探针用于口腔癌诊断治疗

2022-05-20 14:34:20, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：口腔癌是头颈部常见的恶性肿瘤，手术联合放化疗是主要治疗方式。然而，可能导致手术后复发的阳性切缘一直是需要解决的关键问题。此外，放化疗也存在对化疗和放疗耐药、缺乏靶向性、副作用严重等缺点。因此，探索肿瘤手术导航和肿瘤治疗的新方法对口腔癌具有重要意义。尽管新兴的近红外 II（NIR-II，1,000–1,700 nm）区域荧光成像已经彻底改变了手术导航，但仍然缺乏高肿瘤靶向荧光探针。此外，新兴的光热疗法（PTT）虽然可以克服放化疗的缺点，实现肿瘤的精准治疗，但由于缺乏高光热转换效率、高光热稳定性和高穿透性材料，其临床应用仍受到限制。在此，开发了一种用于口腔癌肿瘤成像和 PTT 的 NIR-II 染料 SQ890。SQ890 NPs-Pep通过组装成纳米颗粒（NPs）并用靶向上皮生长因子受体（EGFR）的肽GE11进行修饰，可以通过主动靶向在肿瘤部位特异性蓄积，实现光声/NIR-II荧光双模态成像- 指导口腔癌的PTT。

光热疗法（PTT）作为一种非侵入性治疗方法，因其毒性低、耐药性小、副作用少、肿瘤破坏效率高等优点而备受关注。通过使用肿瘤靶向技术，光热转换剂 (PTA) 在肿瘤部位聚集，并在暴露于 NIR 光时将光能转化为热能以杀死癌细胞。此外，PTA 可用于光声和荧光 (FL) 成像以及 PTT 。在近红外光照射下，肿瘤部位的PTA将激光转化为超声波和荧光信号，可有效定位肿瘤组织并显示肿瘤边界，为肿瘤的完全切除提供相对客观的参考。在本文中，我们合成了一种 NIR-II 染料 SQ890。通过引入强电子供体基团，扩展π共轭体系，形成供体-受体-供体刚性平面共振结构，SQ890的荧光发射波长扩展到NIR-II窗口，提高了组织穿透性深度，并产生更高的信噪比和更好的空间和时间分辨率，在影像引导切除和肿瘤诊断中显示出巨大的应用潜力。此外，SQ890 在 890 nm 处表现出强吸收和高光热转换效率，这对于肿瘤的光声成像和光热治疗都是理想的。由于上皮生长因子受体 (EGFR) 是肿瘤治疗靶点之一，特别是在口腔癌中过表达，因此 SQ890用DSPE-PEG5K-COOH 封装在纳米颗粒 (NPs) 中，并用 EGFR 靶向多肽修饰以实现精确的肿瘤部位靶向。SQ890 NPs-Pep由于主动靶向和增强的通透性和保留（EPR）效应而特异性聚集在肿瘤部位，实现了肿瘤的荧光和光声双模态成像，为肿瘤切除提供视觉指导，并有效同时消融肿瘤组织，在口腔癌的诊断和治疗中显示出广阔的前景。

SQ890的最大吸收峰在890 nm, Q890在808 nm激光照射下表现出显着的浓度和激光密度依赖性温度升高。在10μM的低相对浓度下，SQ890在辐照下5分钟内已经达到约 43℃的致死温度，较高的浓度和激光功率密度提供了较高的温度升高，如图1（b）和1（c）。此外，与吲哚菁绿(ICG) 相比，SQ890 出色的光稳定性在五个激光开关加热循环后得到验证，没有出现温度变化（图1e）。根据图 1(f) 所示的热转换时间常数和最大稳态温度，计算出 SQ890 的光热转换效率约为 59%，这对于肿瘤消融是理想的。除了光热特性外，令人鼓舞的是，SQ890 在 NIR-II 窗口中表现出良好的荧光性能，量子产率为 0.26%。SQ890 的荧光光谱显示最大发射波长约为 980 nm，并扩展到 1,400 nm（图 1（g））。并且，如图 1(h) 所示，SQ890 的荧光强度在照射 10 分钟后显示出可忽略不计的变化。

为了进一步的生物医学应用，将SQ890与DSPE-PEG5K-COOH通过纳米沉淀法组装成纳米颗粒（SQ890 NPs-Pep），然后连接EGFR靶向肽配体构建SQ890 NPs-Pep以实现肿瘤特异性靶向。并且通过上述方法用DSPE-mPEG5K制造了非靶向纳米颗粒（SQ890 NPs）。然后通过动态光散射 (DLS) 和透射电子显微镜 (TEM) 检测 SQ890 NPs 和 SQ890 NPs-Pep 的形态和尺寸，结果显示均匀的球形颗粒形状为 ~ 144 nm 和 ~ 157 nm，具有良好的分散性（图1i、1j）。SQ890 NPs和SQ890 NPs-Pep的电势分别为–17 mV and –10 mV，表明通过 EPR 效应在肿瘤部位积聚。

图 1：SQ890 和 SQ890 NPs 的表征。(a) SQ890（在二甲亚砜 (DMSO) 中）和 NPs 水溶液的归一化吸收光谱。(b) 不同浓度的 SQ890 分散体在 808 nm 激光 (1 W·cm-2) 照射 6 分钟后的温度曲线。(c) 不同功率的 808 nm 激光照射下 SQ890 在 DMSO (40 μM) 中的温度曲线。(d) 808 nm 激光照射 5 分钟后不同浓度 SQ890 的红外热成像。(e) SQ890 和 ICG 五个周期的光稳定性测试。 (f) SQ890 (40 μM) 在 808 nm 照射下的光热性能。插图显示了线性时间数据与从冷却期获得的 -lnθ。(g) SQ890（溶解在 DMSO 中）在 808 nm (1 W·cm-2) 照射 10 分钟后的荧光强度变化。(h) SQ890 在 808 nm (1 W·cm-2) 照射下 10 分钟的 NIR II FL 图像。(i) SQ890 NPs-Pep 和 SQ890 NP (j) 的尺寸分布。插图：TEM 图像。(k) NPs 的 Zeta 电位.(l) NPs 在 4 °C下储存 40 天后的稳定性

使用上述方法将罗丹明 B(Rho B) 封装到 NPs 中，有或没有靶向配体，以检查配体的靶向性。用 Rho B NPs 或 Rho B NPs-Pep 处理高表达 EGFR 的 CAL 27 细胞和低表达 EGFR 的 L-02 细胞 4 h，并通过共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 和流式细胞仪检测细胞对 NPs 的摄取。如图 2(a) 所示，Rho B NPsPep 被 CAL 27 细胞显着内化并发出最强的红色荧光。相反，当 EGFR 被阻断或低表达时，Rho BNPs-Pep 的内化减少并显示出微弱的红色荧光。同时，用 Rho B NPs 处理的 CAL 27 细胞在缺乏靶向性的情况下表现出低细胞摄取。定量流式细胞术分析也提供了类似的结果（图 2（b）和 2（c））。这些结果表明，具有靶向配体的 NPs 结合 EGFR 并触发受体介导的内吞作用，促进纳米颗粒的摄取并确认配体的靶向性。MTT证实了纳米颗粒在浓度达到显示轻微的40 μM的时候几乎没有毒性，证实了其良好的生物安全性（图2d）。此外，流式细胞仪用于确认 PTT 的效果。如图所示。如图2（f）和2（g）所示，用NPs和808 nm激光处理的联合治疗组细胞凋亡率最高，而单药治疗组细胞存活率超过90%，这与MTT检测结果一致。

图 2：CAL 27 细胞的细胞内化和细胞毒性。(a) 通过 CSLM 观察到的 Rho B 标记的 NP 的细胞摄取（CAL27 和 L-02 细胞），比例尺：10 μm。(b) 通过流式细胞术对细胞内NPs 进行定量分析。(c) 细胞内 NPs 平均 Rho B 强度的定量分析。(d) CAL 27 细胞与不同浓度的 SQ890 NPs 或 SQ890 NPs-Pep 在有或没有 808 nm 激光照射的情况下孵育的活力。(e) CAL 27 细胞在各种处理后的活/死图像，用 PI 和 calcein AM 染色，比例尺：100 μm。(f) 活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的定量分析。(g) 通过流式细胞术分析各种处理后CAL 27 细胞凋亡的膜联蛋白 V-FITC/PI染色

由于其光热特性，SQ890 有望成为 PAI 的理想试剂。然后进行体内 PAI 以研究 SQ890 NPs-Pep 作为 PAI 试剂。为此，将 CAL 27 荷瘤小鼠分为 3 组，分别给予 SQ890 NPs（被动靶向）、SQ890 NPs-Pep（主动靶向）和 EGFR 肽+SQ890 NPs Pep（阻断）给药。在注射后 0、2、4、8、12 和 24 小时监测 PA 信号，并通过 ImageJ 测量。如图3（a）所示，在所有3组中都可以清楚地看到PA信号，然而，活性靶向组中的SQ890 NPs-Pep首先在4小时时在肿瘤部位达到最大积累并表现出最强的PA信号，另一方面，来自阻断组和被动组的纳米颗粒仅通过 EPR 效应在肿瘤部位积累，并显示出相对较弱的最大 PA 信号，随后在 8 小时出现。图 3(b) 显示了 PA 信号的半定量分析，验证了 SQ890 NPs Pep 作为 PAI 和肿瘤特异性靶向的显着试剂。

CAL 27荷瘤小鼠的NIR-II FL成像在用上述方法处理后记录。然而，主动靶向组在 4 h 时表现出最强的 FL 信号，而其他两组的 FL 信号在 8 h 时达到峰值（图3c、3d、3e）。

图 3：体内成像研究。（a）PA图像和（b）在各种治疗后的指定时间点获得的肿瘤的相对信号强度。(c) 体内 NIR II FL 成像和 (d) 各种处理后不同时间点相对荧光强度的半定量分析。(e) 肿瘤切除术前和术后。

在患有皮下 CAL 27 肿瘤的小鼠中探索了体内杀肿瘤功效。将小鼠随机分为七组（n = 5）：磷酸盐缓冲盐水（PBS）与激光（空白）、SQ890、SQ890 NPs、SQ890 NPs-Pep、SQ890 与辐照（SQ890+L）、SQ890 NPs 与辐照（SQ890 NPs+L) 和 SQ890 NPs-Pep 辐照 (SQ890 NPs-Pep+L)。在 5 分钟内，SQ890 NPs+L 和 SQ890 NPs-Pep+L 组的肿瘤区域分别达到了 53.9 和 59.6℃的治疗温度。而用 SQ890 和 PBS 处理的小鼠的温度分别温和升至45.9 和 38.2℃（图4a、4b）。与空白组相似，没有光照的小鼠的肿瘤体积在 14 天后大大增加。而在SQ890 NPs+L 和 SQ890NPs-Pep+L 组中肿瘤几乎消退，在SQ890+L 组中受到一定程度的抑制（图4c-e）。H&E和TUNEL染色的肿瘤活检显示激光治疗组的肿瘤细胞凋亡（图 4g），表明治疗效果明显。图4（f）显示在整个治疗过程中任何组的体重都没有显着变化。所有生化参数（肌酸激酶-MB（CK-MB）、尿酸（UA）、肌酐（CREA）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST））均正常（图4（h）），表明对小鼠的副作用可以忽略不计。

图 4：体内治疗研究。(a) 红外热成像和 (b) 不同组小鼠在 808 nm 激光照射 (1 W·cm-2) 下不同时间间隔的相应温度升高。 (c) 每组 CAL 27 肿瘤小鼠的肿瘤体积增长 (***P < 0.001)。(d) 治疗14天后不同组切除肿瘤的图片。(e) 各种治疗的肿瘤重量 (***P < 0.001)。(f) 14天治疗期间小鼠的体重。(g) 不同组肿瘤的 H&E和TUNEL 染色图。比例尺：20 μm。(h) 小鼠的血液生化分析。检查的参数包括 CK MB、AST、ALT、UA 和 CREA。

总之，作者合成了一种NIR-II 染料 SQ890，可用于 NIR 光热疗法和光声/NIR II 荧光双模态成像。SQ890 随后被组装成具有 DSPE mPEG5K 的水分散性 NP，并用 EGFR 靶向肽 GE11进行功能化，以特异性识别肿瘤细胞，补充 EPR 效应提供的区域积累。实验结果表明，SQ890 NPs-Pep 具有良好的 NIR PA/NIR-II FL 成像能力，可指导精确的癌症治疗学和体外和体内的高 PTT 功效。总之，SQ890NPs-Pep 有望成为一种用于肿瘤成像、诊断和治疗的新型 NIR 光疗剂。

参考文献

https://doi.org/10.1007/s12274-022-4239-0

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