ACEA NovoCyteTM流式细胞仪应用——钙流检测

钙是机体内最重要的元素之一，是机体各项生理活动不可缺少的离子，参与一切生命的活动过程，比如骨骼形成，肌肉收缩，神经活动，同时作为细胞内第二信使通过与钙调蛋白（Calmodulin，CaM）结合激活多种蛋白激酶（如腺苷酸环化酶、磷酸二酯酶等）、蛋白水解酶和核酸酶，引起特异的生理生化反应，从而参与细胞代谢、增殖、运动、分化及分泌等功能活动的调节(1,2,3)。因此，钙离子(Ca2+) 测定在生物学及医学研究中有着十分重要的意义。

钙的信使功能是通过调控细胞内游离Ca2+浓度来实现的，因此测定细胞质中的Ca2+浓度十分重要。在多种Ca2+浓度检测方法中，流式细胞术是一种简单、方便及准确的方法。流式方法使用的钙荧光指示剂种类繁多，常见的有Quin-2、Fura-2、Indo-1、Fluo-3、Fluo-4等染料(4)，Fluo-3、Fluo-4以其价格低廉、反应灵敏、可见光激发等优点被广泛应用。Fluo-3 AM和Fluo-4 AM进入细胞后脱去AM酯，与细胞内游离钙结合，488nm激光激发后产生的荧光信号强度与游离钙离子浓度成正比。本文使用ACEA NovoCyte流式细胞仪，以负载Fluo-4/AM后的Jurkat细胞为研究对象，测定了多种外源性刺激物诱导胞浆游离Ca2+浓度的动态变化过程以及激酶抑制剂Ibrutinib的钙流抑制作用。

ACEA NovoCyte流式细胞仪检测钙流

A23187和Ionomycin具有高度的钙离子结合活性，是常用的钙离子载体，在细胞生物学研究中，广泛用于转运钙离子至细胞质或穿过各种细胞膜(5,6,7)。使用ACEA NovoCyte流式细胞仪，可准确地检测细胞内基础钙流水平及A23187、Ionomycin引起的钙离子浓度变化。如图1所示，处于静息状态的Jurkat细胞显示平稳的钙离子基线，当加入A23187、Ionomycin后，在约20秒间隔的起始检测点（图1A-C）检测到钙离子浓度的瞬时升高，短时持续后逐渐下降，A23187引起的钙流变化强于Ionomycin。基于流式检测，以静息状态的钙离子水平为基线，外源刺激诱导的Ca2+浓度变化的动态过程得以呈现 （图1D）。

ACEA NovoCyte流式细胞仪检测A23187、Ionomycin引起的钙离子浓度变化。Jurkat细胞负载Fluo-4/AM（Invitrogen，F-14201）后，调整细胞浓度至1×106/ml，ACEA NovoCyte流式细胞仪上采集静息荧光强度（基线）～2min（采样体积25ul,采样速度14ul/min），然后加入A23187或Ionomycin继续采集100ul样本，共采集125ul终止。DMSO为对照，荧光强度代表细胞内Ca2+浓度高低。A. 加入溶剂DMSO（Sigma-Aldrich）； B. 加入2.5μM A23187（Sigma-Aldrich，C7522）；C. 加入2μg/ml Ionomycin（联科生物，CS0002）；D. 根据基线归零处理后的钙离子浓度随时间变化曲线（n=3，means ± SEM）。归零处理公式：Relative Intracellular Calcium(RIC)=fold of baseline(initial stage) - 1。加入刺激物时间为零点，检测初始点为～20s。

钙是人体不可或缺的微量元素，它既是身体的构造者，又是身体的调节者，是人体的生命之源。对细胞内Ca2+浓度的准确检测，能让我们更全面的了解其在细胞功能上的调控过程，能让我们更深入的认识许多生理病理过程和药物作用机制。ACEA NovoCyte流式细胞仪检测钙流具有准确、高灵敏度和高稳定性的特点，助力于钙离子及相关的实验研究。