替格瑞洛的亚硝胺杂质“李鬼”记

替格瑞洛，英文名Ticagrelor，是由英国阿斯利康公司研制开发的一种治疗急性冠脉综合症的药物，于2011年7月被美国FDA批准上市，国内也有很多制药公司正在仿制这款药物，其结构式如下：

图1.替格瑞洛结构式

亚硝胺化合物是一种潜在的基因毒物质，被国际癌症研究机构（IARC）列为人类可能致癌物。在2018年3月FDA发布的ICH M7指南（Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk (March 2018)中亚硝胺被列为警示结构关注化合物，2021年2月FDA又发布了关于人用药物中亚硝胺杂质控制的指南（Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs Guidance for Industry），因此在药物研发过程中需要严格控制亚硝胺杂质的含量。药物审评过程中亚硝胺杂质也一直是关注的热点。

替格瑞洛结构式结构中含有二级胺结构，同时其合成工艺中使到了亚硝酸钠和乙酸，具有生成相应亚硝胺结构杂质的风险，有多家申报厂家被CDE发补要求研究和控制该亚硝胺杂质。有专利报告了该亚硝胺杂质的结构及合成方法，即用替格瑞洛API与亚硝酸钠在酸性条件反应，可得到目标亚硝胺结构杂质，其化学反应方程式如下：

图2.专利中替格瑞洛亚硝胺杂质合成反应方程式

按专利合成方法，顺利合成得到了目标杂质，LC-HRMS分析确定合成杂质的分子量与元素组成与目标亚硝胺杂质一致，NMR碳谱与氢谱分析确定碳氢个数与目标亚硝胺杂质结构也相符。

图3.目标杂质的氢谱和碳谱，氢谱和碳谱的谱峰个数基本与目标结构式一致。

由于替格瑞洛亚硝胺杂质没有毒性数据，因此需要依据一般亚硝胺杂质18ng/天计算其控制限度，据此计算的该亚硝胺杂质控制限度为0.1ppm。按该控制限度开发LC-MS/MS的方法用于检测替格瑞洛API及制剂中该亚硝胺杂质，检测结果显示多个厂家的API与制剂（包含参比制剂 ）均检出此亚硝胺杂质，检出水平在0.3~0.7ppm水平不等，此检测结果意味着替格瑞洛这个种品种具有重大的安全性风险。因此需要对该研究过程进行再次仔细复核。

在复核的过程中补充了按专利合成出杂质的全套2D NMR谱图，对其结构进行重新表征。在使用ACD/NMR Workbook 软件对谱图和结构进行归属验证时发现了几处问题。发现合成杂质的HSQC和HMBC谱图中都存在信号与结构矛盾的地方。

图4.HSQC和HMBC谱图中信号与结构矛盾的位置，上图HSQC中红色蓝色标示的信号结构矛盾的位置，下图HMBC中紫色标示的信号结构矛盾的位置。

在ACD/NMR Workbook软件中对结构和信号归属完成后，软件会在结构上用色块来显示归属质量，绿色色块表示该位置原子的实验化学位移与理论化学位移偏差不大，红色表示该位置原子实验化学位移与理论化学位移偏差较大。从归属质量检查的结果来看除了三元环外的大部分结构与谱图信号相符，结构上红色箭头所指CH片段只连接一个电负性原子N原子，理论上的碳谱峰的化学位移达不到HSQC信号上的82ppm（谱图上红色圈圈位置），实验化学位移数值偏大，通常出现在此化学位移位置的sp3杂化碳原子需要连接两个电负性杂原子。结构上蓝色箭头所指CH₂片段对应HSQC谱图上信号碳谱化学位移为38.7ppm（谱图上蓝色圈圈位置），化学位移数值偏大，通常来讲三元环上碳的化学位移数值都比较小。另外HMBC谱图上显示2F取代苯环上两氢与一化学位移为155ppm的碳有相关信号（谱图上紫色圈圈位置）对应结构上的位置为三元环紫色箭头所指碳原子，这与该原子理论化学位移相差甚远。因此该结构存在问题，与谱图信号严重不符。

那合成的杂质到底是什么结构呢？接下来可以使用ACD/Structure Elucidator Suite来做未知结构的解析工作，由于原先结构中除三元环部分外我们通过人工确认并没有问题，因此这些没有问题的结构部分我们可以通过给定软件分子连接图（MCD）中对应原子连接顺序的方式告诉软件，剩余未知的部分由软件通过自由组合的方式来解析。

图5.MCD图中自定义原子连接顺序，左图为信号处理完成后的原始MCD图，右图中新增的蓝色连接线为自定义连接。

修正MCD图后，让软件自动生成结构，很快软件一共生成了17个不同结构，使用碳谱氢谱化学位移平均偏差参数d_N(¹³C+¹H)对结构进行排序，找到了一个最优结构如下图所示

图6.软件生成的结构列表，通过碳谱氢谱化学位移平均偏差参数d_N(¹³C+¹H)排序找到的最优结构。

再考察生成的结构列表中排名前三的结构，碳谱氢谱化学位移平均偏差参数d_N(¹³C+¹H)的数值其实比较接近，且第二个结构如果只单纯考虑碳谱的平均偏差其实似乎更合理，其d_N(¹³C)数值更小只有1.55，这时就需要从化学反应机理上来进一步说明新结构的合理性。

图7.生成结构列表中排名前三的结构

替格瑞洛在酸性条件下二级胺NH发生重排生成亚胺结构，然后亚硝酸N原子和苯环的苄基位发生亲电反应，再在亚胺的C=N双键碳的位置发生O原子亲核反应，最后脱去一分子水形成五元环结构。详细的反应机理如下图：

图8.替格瑞洛杂质反应机理

回到化合物的NMR谱图，新的结构中氮氧五元环中CH连接两个杂原子其化学位移为82ppm比较合理，CH₂连接吸电子基团C=N双键其化学位移为38.7ppm也较为合理，另外HMBC上与2F取代苯环氢相关的碳为C=N基团的碳，其化学位移为155ppm也是合理的。所以综合谱学和化学反应机理均可确认新的氮氧五元环结构为合理结构，也就是说按照专利中合成亚硝胺杂质的方法得到的杂质并不是替格瑞洛亚硝胺杂质。

图9.生成产物为氮氧五元环结构。

为了研究的严谨性，设计了很多不同条件下的亚硝酸盐与替格瑞洛API的反应，生成的产物LC-MS检测的结果表明产物均为氮氧五元环结构，没有生成替格瑞洛亚硝胺杂质。因此替格瑞洛品种中生成亚硝胺杂质的风险很小。

接下来再来考察新结构的基因毒性风险，将结构放到ACD/Percepta基因毒软件中进行预测，综合软件的专家规则和QSAR模型分析后，发现该结构属于ICH M7指南中划分的5类结构，没有致突变风险。

图10.　ACD/Percepta中基因毒预测结果

最终调查结果为按专利合成出来的杂质根本不是亚硝胺杂质，而是同分子量的氮氧五元环结构杂质，该杂质经毒理软件软件预测不具有致突变风险。开展系列放大风险的模拟反应及反应机理研究，亦证明替格瑞洛与亚硝酸根反应只有会产生成氮氧环杂质，而不会产生相应亚硝胺杂质。此发补研究最后顺利通过了CDE评审。

阎作伟的Comments:

在药物杂质的结构鉴定的过程中单纯氢谱碳谱的结构确认存在一定的风险。解析结构时结构的合理性需要结合反应机理和谱学特征进行综合判断。ACD/Labs的高效率的结构确证工具NMR Workbook Suite(点击查看)和结构解析工具Structure Elucidator Suite（点击查看）能够给药物分析专家赋能，令其研究能力和效率都获得提升。