基于AQbD的HPLC分析方法开发以及案例分享

ACD/Labs

本文内容是2022年3月-4月同写意系统化分析方法开发系列网络培训的第四节的部分内容。应听众的要求，我们将把此次系列演说的内容以文字的形式重现，以期令更多的读者可以有更深入的学习和讨论的机会。

本次的分享分为以上三个部分。第一部分对AQbD的理解，第二部分武汉嘉诺康公司分析方法开发DOE案例分享，第三部分武汉嘉诺康公司利用统计学方法进行分析方法耐受性研究。

分析方法开发是一个不断转变，逐步加深理解的过程，截止目前，常用的分析方法，依然是试错法和单因素考查法，通过考查条件变化时，目标化合物的对称因子，理论塔板数等，最终确定我们的分析方法。

这类方法容易出现的问题如图所示：我们找到的是局部最优解，而非整体最佳方案。

同时，在用单因素方法进行考查时，还容易忽视各因子之间的交互影响。如图上所示，雄兔和雌兔之间，会发生交互，只有雌雄同笼时，才会有响应发生。而实际的分析检测同样如此，各检测条件之间，也会发生交互影响，仅仅进行单因素考查，就会忽视因子之间的交互作用。

这就使得试错及单因素考查的方法，本身就可能出现一些问题，耗时长，未考虑交互作用，由于前期未进行风险评估，方法耐受性差，从而使方法在转移过程中，容易出现问题。

公司在方法转移过程中，就曾出现类似的问题。产生的原因，可能是从WATERS转移至THERMO上时，不同品牌仪器滞留体积不同，也可能是方法在开发过程中，风险评估不充分，方法的pH值离pKa太近，导致部分对pH敏感化合物保留受pH影响较大，使分离出现问题。

ICH的Q14草案，对分析方法开发向AQbD转变，提出了明确的要求。

同时Q14也给出了相应的分析方法开发流程图。强调了ATP，风险评估等等。

从试错到单因素考虑，到AQbD，其主要的区别，在于方法建立阶段，ATP的确定及风险评估，确定CQA，方法优化阶段采用DOE的方式进行方法优化，充分了解方法的知识空间，建立方法的可操作空间。

分析方法开发，正逐步向AQbD转变。

从试错向AQbD转变，其基本的分析方法开发框架流程如图如示。注意在方法开发阶段，进行风险评估，筛选关键因子，进行DOE建模，评估参数影响并确定MODR。

依照不同的方法，我们应建立不同的风险评估表，针对CQA，评估不同影响因素的影响。

软件建模方法参数筛选和优化如图所示，可供参考。

各种信息学和统计学软件的出现，为方法开发从试错向AQbD转变提供了可能。在DOE阶段，可以使用ACD，在后期方法耐受性评估阶段，可以使用MINITAB，JMP等。

第二章，本公司案例分析。

本公司目前的方法开发决策树如下：拿到合成工艺路线后，根据结构已知或未知，获得物质的logD叠合图，再进行下一步，pH的筛选。以峰型，峰数量和选择性确定pH，再进行色谱柱，流动相优化，同样以峰形，峰数量和选择性，确定色谱柱和流动相。然后进行梯度及温度的优化建模，根据分离度，运行时间，耐用性为标准，最终确定分离条件。

案例1如图所见

该案例中，部分杂质无保留，还有部分杂质保留太强，在下一针空白中出峰，因此药典方法，基本不适用。

对待测化合物测定logD，多种杂质的logD随pH影响极大，在酸性条件下，显示logD曲线相对较缓，但是考虑到初步筛选，依然选择四个不同的pH进行筛选，同时多种化合物显示logD较小，说明常规C18柱可能保留较弱。

选择pH2.5，7.5，5.0，10.0，分别选择磷酸盐，醋酸盐，氨盐三种缓冲体系，酸性条件下，pH2.5时，保留及峰形都相对较好，因此选择pH2.5。

考虑到待测物保留相对较弱，在筛选色谱柱时，选择了亲水柱，典型的广pH xbridge柱，考虑到待测物有苯环，选择了部分苯基柱。

筛选结果：在T3柱上，峰数量最多，不对称度较好，最早出峰化合物保留满足要求，选择T3柱。

T3色谱柱如图所示。

进行弱洗脱流动相的筛选，考虑到化合物保留较弱，选择了两种离液剂TFA以及高氯酸钠，同时也使用了常规的磷酸盐作为缓冲盐体系。结果表明，强离液剂高氯酸钠，可以明显改善峰型，增强保留，并影响难分离化合物的分离，如图所示。

在高氯酸钠体系下，化合物的分离，保留，峰型都有明显改善，因此选择了高氯酸钠磷酸盐体系。

考查盐浓度的影响，在50mM的高氯钠浓度下，分离效果最佳，出峰最多，选择50mM高氯酸钠盐。

筛选pH，色谱柱及弱洗脱流动相之后，确定了开发的一些关键因素，进一步进行DOE实验设计，对实验数据进行建模，进行方法优化。

进行了三因素的建模，条件如图：

通过18针的实验，ACD给予的建模如图所示：显示所有色谱峰，均能实验分离。

将分离空间进行放大，所有橙色区域以内的部分，均为方法的耐受性空间，在此空间范围内，均能达到化合物分离度大于1.5的要求。

对ACD给予的方法进行上机验证，所有杂质均实现了分离，分离度大于1.5，满足要求。

案例2同样为某API中控方法的建立。

首先进行待测物logD的评测，logD较小，提示该化合物存在保留风险。

进行pH值的筛选，根据logD，由于存在保留风险，因此在进行酸性pH筛选时，直接加入离液剂高氯酸钠增强保留。

同时这步评估主要是评估化合物的峰型，希望主峰不对称度良好。筛选结果表明，在pH2.5，使用高氯酸钠体系时，满足要求，因此选择pH2.5。

进行色谱柱的筛选，一共选择了6根色谱柱，这步的筛选，主要是考虑到主峰与中间体及有关物质的分离。

筛选结果，在XTIMATE上，分离出的色谱峰个数最多，因此最终选择该色谱柱。

进行梯度和温度的DOE实验设计，由于前期条件筛选不充分，只进行了色谱柱和pH的筛选，因此分离度均不能满足要求。

进行流动相的筛选，发现流动相的比例，对分离有较大影响。

进行了三因素的筛选，分别为梯度，温度，混合有机相。在进行ACD模拟时显示，预测色谱峰可以实现完全的分离，出现大面积可分离空间。

根据ACD模拟给出的最优条件，进行上机实测，结果显示，所有杂质均实现了分离，分离度满足要求。

实测图与模拟图对比，几乎完全重合。

利用ACD建立的液相方法，通常在方法建立阶段，也会进行DOE实验设计与筛选，但是DOE实验一般是3因素3水平。然而在实际的实验过程中，影响因素较多，远远超过3因素。

利用常规方法来考查较多的影响因素时，实验所需个数较多，从时效性上，很难满足要求。

利用统计学PB实验来进行影响因素分析时，我们进行8因素研究，总共只需要进行15次实验，就能给予我们需要的结论，大大增加时效性。

如图为常规的实验条件

如图所示，在常规实验条件下，有部分关键分离对分离度可能存在耐受性问题。

对方法进行评估，我们将所有列入风险的因素，综合考查。

选择方法的高低水平及相应的关键方法属性和限度要求。

利用MINITAB，进行PB实验的耐用性研究，运行序列随机化。

结果如图，除了分离度2，其他方法属性在高低因子水平内，均能满足要求，分离度2在极限条件下为1.2，接近限度要求。

同时，从PB实验分析图中，我们还能得到其他有用信息。如通过显著因子的绝对值判断哪些因素对响应有显著影响，绝对值越大，影响越大。同样的，对于主效应图的理解，斜率的绝对值越大，影响越大。

将预测结果与实际实验结果进行对比，对比结果如图所示：从图中可以看出，实验值与拟合值的差异在0.8%-13.2%，与文献报道基本一致，即模型基本与实际结果相一致。

通过PB研究，我们可以判断，对于我们设定的关键方法属性和限度要求，在高低因子范围内，预测显示基本都能满足要求，唯独分离度2，已经接近限度要求1.2，对于分离度2来说，对他影响最大的为流速，因此，我们的设计空间要严格的限制流速。

同时，通过PB的等值线图，我们也可以判断对于关键方法属性有重要的影响因素。

通过PB的耐用性研究，建立起整套方法的知识空间和可操作空间。了解对于每一个关键方法属性有影响的因素及影响因素的大小，为之后的方法验证及转移打下良好的基础。