使用 SoftMax Pro 7 软件进行生物相对效价的测定

生物相对效价介绍

平行性检验的两类方法

生物检定法的统计分析步骤

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首先需要根据所检测产品的剂量-反应曲线选择合适的统计分析模型。模型筛选需要复杂的计算，所以建议使用专业的统计软件来协助完成^{[ 3 ]}。SoftMax Pro 软件提供 Liner、semi-log、log-log、4p-logistic 等 21 种线性和非线性曲线拟合模型进行选择和比较，并且通过决定系数 R²、失拟 F 检验(残差平方和 SSE 和校正赤迟信息准则 AICc )及参数独立性( independence )来判断曲线模型拟合优劣，以此验证模型的有效性^{[ 5 ]}。

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对于实验设计类型，根据不同的测定方法可加以限制的因级数来选择。药典给出了三种实验设计类型：随机设计、随机区组设计和交叉设计。

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对于异常数据的处理药典提出了狄克森（ Dixon ）检验法和格拉布斯（ Grubbs ）检验法。SoftMax Pro 7.1x 软件增加的 ESDMarkOutliers 函数可进行 Grubbs 检验法的检查，当指定异常值数目和检验的显著性水平之后，软件会给出这组数据中的异常值，并将其标记为“ Outlier （离群值）”，如图 2 所示。

图 2 ：SMP 软件中 Grubbs 检验法计算

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实验数据的统计分析，首先要满足三大前提条件：数据具有独立性、正态性和方差恒定，才能确保所计算的结果具有可靠性。数据独立性一般通过实验设计和具体操作要求进行保证，比如：在细胞类生物效价测定实验中，避免使用有严重位置效应的细胞孔；由于生物实验的变异大，在各样品不同剂量组设置多个重复样本；尽量使用 2 个以上的高浓度样本进行独立的系列稀释等。

当生物效价测定的结果不符合正态分布或方差齐性时，需要先对原始数据进行相应的转换，如对正偏态的数据使用对数转换，对于泊松分布的数据使用平方根转换等。如果转换后还达不到要求，需要再采用狄克森法或格拉布斯法进行必要的异常值检查和剔除^{[ 3 ]}。当组内方差有明显差异时，通过加权的方式对曲线进行计算，使用合适的权重因子来调整数据，以便减少高浓度与低浓度之间的浓度偏差^{[ 6 ]}。然后对实验数据进行平行性检验的统计分析，以四参数回归计算法为例，我们参照生物检定法的实例 6 人粒细胞刺激因子( GCSF )生物学活性测定— NFS-60 细胞/ MTT  比色法的方差分析公式，使用 SoftMax Pro 7.x 软件进行统计分析，其分析结果与药典实例 6 中的分析结果完全一致，如图 3 所示。

图 3 ：SoftMax Pro 7.x 软件四参数回归计算法方差分析的结果（a）和 药典实例 6 中展示的方差分析结果（b）

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根据 F 检验的统计分析结果，如果符合药典生物检定法中可靠性测验结果判断的条件，那么实验结果被认为是可靠和有效的。只有实验结果是有效的，方可按等反应剂量比的原则，采用约束模型中的标准品和测试品的剂量-反应曲线来计算相对效价。在 SoftMax Pro 7.x 软件中，对于平行直线模型的相对效价可以使用函数 RelPotPLA 进行计算，对于四参数模型的相对效价可以采用标准品和测试品约束拟合曲线的 EC50 的比值来计算。使用函数 RelPotCILowerPLA 和函数  RelPotCIUpperPLA 计算置信区间的下限和上限。在 SoftMax Pro 7.x 软件中药典实例 6 的实验结果判断及相对效价和相对置信区间的计算结果，如图 4 所示，这与药典中的计算结果（未展示）也是完全一致的。

图 4 ：SoftMax Pro 7.x 软件药典

实例 6 的相对效价和

相对置信区间的计算结果。