微生物专题 | 常见十一种类型样本采集具体步骤

1.样品应在不同的采集点进行可重复的方式采集，使用相同的采样步骤和相同的消耗品（试剂、耗材），消耗品最好品牌和批号一致。

2.采集和储存的样本应尽可能接近动物体内情况。

3.在采集步骤中应考虑样本采集的实用性，以便能够方便地采集足够数量的样本。

1.准备好便盆和粪便容器,洗手,带上手套收集新鲜的粪便样本;

2.在实验室将装好受试者粪便样本立即放在冰上进行分装并标记;

3.用无菌牙签、勺子或粪便取样器截取样品中段里部(粪便表层含有肠粘膜脱落细胞),外部容易污染,且接触空气后,部分细菌DNA开始降解;

4.样品采集时建议将样品按照一次提取的量进行分管保存，避免提取时由于二次分管和并管引起样品降解；每管可收集分装1 克（建议3g），置于 5ml EP 或 15ml、50ml离心管中，取样完毕后盖上盖子旋紧，用封口膜封口，尽可能保持样品处于厌氧环境（如有条件可以使用厌氧袋）;

5.分装好后,若当天提取DNA,可以先放4°C,长期存放需先迅速放入液氮中,之后立即放入-80°C保存，避免反复冻融;

6.寄送时将样本管放入更大的管或者自封袋中，防止样本运输过程中被破坏，并用大体积干冰运输，保证开箱验收时有足够干冰剩余。

注意事项：

●如粪便样品量较多或不能马上收集,最迟要在2小时之内全部收集完；

●如粪便样本采集需要在不同天进行，须在同一时段进行（最好是早晨），避免微生物组成在同一天不同时间内发生变化。

1.在实验对象死亡后，用无菌解剖刀，在无菌状态下取出整个肠道，切取所需肠段的内容物（条件允许的话，可在无菌操作台进行）；

2.用无菌手术刀挖取内容物，立即放在冰上进行分装并标记；

3.用灭菌离心管分装，单个样本取样量：200-500 mg/管，为保证实验顺利进行，每个样本取多管备份，在采样允许的情况下，尽量多采集样品；

4.分装好后，若当天提取DNA,可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存；

注意事项：采集好的样本30min内液氮速冻放入-80℃冰箱保存。

组织样本用无菌磷酸盐缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出；用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织细菌进行DNA 的提取；长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C 保存；

注意事项：

同一实验取样部位需保持一致。

1.咽拭子:明亮的光线从检查者肩膀上方照射进张开的口腔，让患者深呼吸，然后发“啊”音，用压舌板轻轻压舌，再用洁净的咽拭子来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，然后将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。

2.鼻拭子:尽可能使明亮的光线照进鼻腔，将洁净的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中，尾部弃去，拧紧盖子。

注意事项：

●咽喉取样时，拭子不能接触到口腔和舌粘膜。

●取样时间最好在发病72 小时内，晨起后。

●鼻腔和咽部样品，可只收集一种，也可同时收集2种并混合。

取标本前要洗手，以及实施其它必要的清洁措施，尿液收集容器应贴有标签，并核对信息，留取所需实验的最小样本量（5ml），取标本时避免污染，取好后，将容器盖好，防止尿液外溢，并记录标本留取时间，放于-80°C 保存，也可离心取沉淀（1g）放于-80°C保存；

注意事项：不建议存储在4◦C，尿样会发生显著的变化。

1. 小鼠肺泡灌洗液

一般为颈部和胸部解剖，气管和一侧肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端，生理盐水或PBS 反复冲洗，一般为3 遍，每遍冲洗次数根据需要决定，3-5次即可，具体操作参考：

1）操作所需的设备（除了一次性注射器，气管插管是已经灭菌的，其他设备都需要高压灭菌）；

2）小鼠麻醉并固定；

3）颈部去毛并消毒；

4）从颈部正中切口；

5）暴露剥离气管，并在气管近端穿线打活结，活结要比较松；

6）在所打活结的远端，剪开气管的1/2，行气管插管，插入后线打死结；

7）用10ml 注射器抽取10ml 的灭菌生理盐水，通过气管插管注入气管内，反复抽吸三次，将液体抽出，大约能吸出7 毫升左右，放入灭菌离心管内。再抽取10ml 生理盐水，重复上面的操作两次，这两次每次能抽出肺泡灌洗液9ml 左右，也注入离心管；

8）收集的灌洗液采用0.22um 滤膜过滤，后将滤膜冻存－80°C 保存，或直接提取DNA。

2. 人肺泡灌洗液

1）1%的利多卡因对患者进行口咽部局部麻醉，静脉推注咪达唑仑5mg；

2）患者取仰卧位，予吸氧、心电血压监测；

3）用支气管镜行支气管肺泡灌洗术，经气管镜活检孔注入1%利多卡因局部麻醉，将气管镜嵌入右肺中叶或左肺上叶舌段的一个亚段，共注入120mL 加热至37℃的生理盐水，50mL注射器回收，尽快4℃运送回实验室；

4）分装后高速离心，15600×g4℃离心30min，弃上清，细胞沉淀-80℃冻存备用。

注意事项：肺泡灌洗液不同个体样本浓度可能不一致，取样过程中尽量保持取样量一致性。

EDTA 抗凝管：抽取3-5ml 全血，颠倒混匀EDTA 和全血，保证抗凝效果，-80℃（-20℃）保存（由于会影响实验，不能使用肝素抗凝），冷冻后，干冰运输。

分离胶真空采集管：分离胶置于试管底部，注入血样待血液凝固后置离心机中离心，分离胶即在血清、血块之间形成隔离层。并使血清保持原状，无改变，-80℃（-20℃）保存。

注意事项：

●血液样本一定要避免反复冻融，如果血液放置时间过长，或经历过反复冻融，请务必提前沟通，以尽量保证血液样本核酸提取质量。因放置过久或经历过反复冻融的样本经常会发生细胞核破裂，核酸游离于血浆中。加入抗凝剂后的新鲜血液一般可以在4℃放置 12-24小时，但经过速冻后的样本一定要低温保存。切记血液样本一定避免反复冻融。

●血液样品应使用塑料材质的采血管送样，避免使用玻璃材质采血管送样或装液太满，以至冻裂。

患者胆总管胆汁在进行ERCP 手术时收集，使用严格无菌的侧视内窥镜进行ERCP手术，在将内窥镜由嘴经十二指肠放入胆总管吸取胆汁之前，内窥镜的操作孔道通过避免任何吸入操作来避免污染。在打入造影剂前，使用通过操作孔道的无菌的括约肌切开器导管从胆总管中抽取3-5ml 胆汁，取出的样本立即放入无菌痰杯并放－80℃保存。

1.普通土壤样本

根据研究目的确定采样范围，取样器具要事先消毒灭菌处理，开始采样，去除表面浮土，使用乙醇火烧的铲子挖取地下5~20cm 的土层，去除可见杂质后，土壤过2mm筛网，每个样品从 3个及以上采样点采集并混合而成，去除杂质之后的样品每管可收集分装3g-5g，保存于无菌离心管中，置于0℃以下运回实验室，用于抽提DNA，如不能马上实验，置于-80℃保存。土壤样品强烈建议使用5 ml EP 或15ml、50ml离心管进行装载，并用封口膜封口，使用自封袋容易撒漏导致样品交叉污染。

2.根际土壤样本

使用的工器具要事先消毒灭菌处理，采集20cm 深的根际土壤于50mL 的无菌管里，迅速放在液氮里储存，用20 目的筛子过筛，去除植物根、动物残骸以及其他杂质后分装到无菌离心管里，每管3~5g，密封后立即-80℃储存备用。

将所研究的物体放在事先灭好的无菌容器当中，加入PBS 缓冲液后进行振荡，使得微生物从物体表面充分的脱落并聚集在PBS 缓冲液当中，之后直接提取PBS 缓冲液中的微生物或者将缓冲液用滤膜过滤之后再进行DNA 的提取。

用流水冲洗植物根样本表面并摘到小侧根，粘根土壤粒要进行化学消毒（95%的次氯酸钠2min），用无菌玻璃珠在无菌水中剧烈摇晃，物理去除细菌。之后用手术刀片划开根部组织以释放内生菌，用无菌玻璃珠在9%的生理盐水中振荡，在30℃的条件下振荡4h 以分离内生菌，之后用5μm 滤膜过滤，15000r，4℃离心收集沉淀并置液氮中保存。

部分参考文献：

1.Stephens W Z, Burns A R, Stagaman K, et al. The composition of the zebrafish intestinal microbial community varies across development[J]. The ISME journal, 2016, 10(3): 644.

2.Roeselers G, Mittge E K, Stephens W Z, et al. Evidence for a core gut microbiota in the zebrafish[J]. The ISME journal, 2011, 5(10): 1595.

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