应对AAV与溶瘤病毒的质控难题 ——丹纳赫生命科学xHIBIO .创新加速营线上培训精彩回顾

2022-04-25 18:03:53 丹纳赫生命科学

近几年，基因疗法蓬勃发展，正在进行的千多项基因治疗临床试验中，都离不开病毒载体。病毒载体，它将外源基因片段递送到人体细胞中，发挥着重要作用。

目前，在基因治疗领域中常用的病毒载体有腺相关病毒AAV，慢病毒LV以及以腺病毒、单纯疱疹病毒为代表的溶瘤病毒。虽然基于病毒载体的基因疗法市场发展空间广阔，但也存在诸多挑战。如生产涉及多个细胞系的使用，工艺流程及表征、质控方法标准不统一等。因此，在工艺优化中需要使用多种表征方法加强病毒载体的关键质量属性分析。

4月19日丹纳赫生命科学集结旗下贝克曼库尔特生命科学和SCIEX，联合北京昌发展为大家带来了一场AAV 与溶瘤病毒表征的线上课程，从聚集体、空壳率、蛋白结构、纯度等不同维度，详细介绍了两种病毒载体的表征方案，为应对相关质控难题提供有效的解决方案。

贝克曼库尔特生命科学余启昆：

AAV 和溶瘤病毒的空壳率及聚集体检测

AAV是由二十面体样的衣壳包裹单链DNA组成，在制备过程中，除了含有全长DNA基因组的完整AAV载体外，有一定比例的不含任何DNA基因组、包含部分DNA基因组以及DNA过度装载、AAV多聚体等各种错误组装的AAV，这都可能会影响AAV载体的有效性和安全性。

分析超速离心技术 (AUC) 是测定蛋白质或其他大分子的分子量、流体力学和热力学性质的全面而精准的手段。Optima AUC分析型超速离心机整合了超速离心机促使颗粒沉降的能力和光学组件检测不同时间沉降状态的功能。作为行业公认的标准方法之一，AUC非常适合进行AAV空壳率检测。其具有良好的一致性和较高的分辨率，能够准确反映不同生产工艺结果的细微质量差别，适用于产品研发和放大过程中的质控管理。诺华的AAV基因疗法Zolgensma正是采用了该方法学来检测其生产的AAV药品质量。

溶瘤病毒可通过直接杀死肿瘤细胞并引起机体的免疫反应发挥作用。然而天然溶瘤病毒有一定的局限性，因此需将各种不同的病毒作为载体，通过基因修饰的方法增强或减弱病毒毒力并导入新的功能性基因，以提高其溶瘤作用。目前，全球有四款溶瘤病毒产品获批，国内获得CDE受理的溶瘤病毒产品也超过了20个，载体种类以腺病毒为主，主要包括腺病毒、疱疹病毒、柯萨奇病毒等。

2020年国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布关于公开征求《溶瘤病毒类药物临床试验设计指导原则（征求意见稿）》意见的通知，指导原则在产品的纯度和杂质检测方面提出了要求，建议关注非完整包装病毒（如非包膜病毒、空壳病毒等）、病毒颗粒聚集体等。

贝克曼库尔特的Optima AUC分析型超速离心机也是进行溶瘤病毒空壳及聚集体检测的有效方法，目前已有诸多文献报道了AUC在腺病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒等检测中的应用。

SCIEX 赵颖华博士：

高分辨质谱在AAV衣壳蛋白表征中的应用

不同AAV血清型指病毒具有不同的衣壳蛋白，AAV进入细胞的过程依赖于细胞表面糖基化受体识别AAV衣壳蛋白，因此AAV衣壳蛋白决定了其组织靶向的特异性，对AAV衣壳蛋白进行全面表征，能够对AAV不同血清型的研究，衣壳的改造、质控方法的选择、工艺的优化具有重要的参考意义。

来自SCIEX的应用工程师赵颖华博士通过一些案例，从完整分子量、肽图、翻译后修饰等方面对不同细胞系产生的AAV衣壳蛋白的属性进行了对比分析。首先比较了SF9和HEK293两种宿主细胞培养体系产生的AAV三种结构蛋白的分子量，从解卷积后的质谱图来看，没有修饰蛋白的分子量基本一致，但是发生修饰的部分变化较大，SF9细胞培养体系中VP1和VP2的磷酸化水平升高，HEK293细胞培养体系中VP3的乙酰化更加完全。在肽图的分析中，通过对一二级图谱的结合分析，不仅可以发现样本中发生的翻译后修饰，还能判断修饰位点信息，从而整体了解AAV衣壳蛋白表达情况。

SCIEX最新推出的高分辨质谱ZenoTOF^TM7600系统采用了Zeno™ trap(Zeno阱)技术，克服了正交TOF技术在传统上占空比挑战，提供了高达 20 倍的灵敏度，尤其是EAD的碎裂模式，通过调节电子能量来改变碎裂模式，可从不同的化合物类型中提取和量化新的结构信息。在AAV的衣壳蛋白表征中，通过EAD模式进行肽图分析，一级的覆盖度可达100%，有二级确认的序列覆盖度超过95%。

丹纳赫生命科学徐玲丽：

毛细管电泳在AAV检测中的应用

毛细管电泳作为常用的生物药表征分析工具，已经广泛并成熟地应用于单抗的纯度和电荷异质性检测。SCIEX还开发了基于毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统在核酸和病毒载体检测方面的应用。AAV的制备通常采用三质粒共转染的方式，从质粒的构建到下游纯化，PA 800 Plus可进行质粒的拓扑结构分析、AAV衣壳蛋白纯度分析、AAV包装基因组的完整性分析，AAV衣壳蛋白的等电点检测、宿主细胞残留DNA的片段分布分析等各类应用。

PA 800 Plus采用激光诱导荧光的检测方式，可对质粒的三种拓扑结构进行高效分离，并能准确计算超螺旋结构的百分比，此方法已进入2020年中检院的标准提升项目中，并于2021年完成了全国性的联合验证。

对于AAV衣壳蛋白的纯度检测，需要根据不同的血清型优化CE-SDS样本缓冲液的百分比，加标记染料的孵育时间等，以达到最佳效果。期间，展示了不同条件下的电泳检测结果，以帮助用户更好地理解和使用此方法。另外，SCIEX最新推出的BioPhase 8800新一代多通道毛细管电泳系统，能够同时进行八个样本的检测，不仅能缩短实验优化的时间，其结果的重复性、稳定性以及跟PA 800 Plus结果的一致性可以方便地进行方法的转移。

对于宿主细胞残留DNA（HCD）的片段分布分析，PA 800 Plus采用激光诱导荧光的检测方式，能够大大提高核酸片段检测的灵敏度。相较于Realtime PCR的方式，PA 800 Plus不用进行样本的扩增，能够得到更加真实和全面的HCD分布信息。

丹纳赫作为全球生命科学服务领域的创新者，正持续不断地探索和开发更多生命科学相关的技术与方法，为推动全球的生物技术发展贡献应尽之力。丹纳赫中国生命科学研究院基于丹纳赫生命科学平台旗下多家公司的先进科技，立足中国客户的实际需求，开发了精准医学和生物制药相关工作流程的培训课程，旨在为中国精准医学及生物制药的研究者提供更为优质和便利的系统性培训服务，帮助用户快速了解行业的新工作流程，熟悉流程的核心技术，掌握相关产品的使用。欢迎关注和参与我们的课程，期待与您的互动！