DMPK专栏 | 使用 LC-MS/MS 快速测定人血清中的阿昔洛韦及其主要代谢物

2022-04-15 13:05:30 艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

摘要

描述了一种基于 MS 的新型分析方法，用于同时分析人血清中的抗病毒药物阿昔洛韦、其代谢物9-羧基甲氧基甲基鸟嘌呤、更昔洛韦和喷昔洛韦。这些抗病毒药物对疱疹病毒感染有活性。阿昔洛韦和喷昔洛韦被认为是安全有效的药物，具有轻微的副作用，如头痛和胃肠道不适，而更昔洛韦被认为毒性更大，已知会引起例如骨髓抑制。阿昔洛韦的主要代谢物9-羧基甲氧基甲基鸟嘌呤是推定的神经毒素，应在肾功能受损或有神经毒性症状的患者中监测。使用含有同位素标记内标的1% 甲酸甲醇进行蛋白质沉淀制备样品。联苯柱色谱分离和质谱检测在多反应监测 (MRM) 模式下进行，ESI 在正离子模式下，在 3 分钟内完成。质量控制的日间分析准确度在 95% 和 104% 之间变化，而日内分析准确度在 93% 和 105% 之间变化。质量控制的日间和日内测定不精确度分别在 1.4% 和 4.2% 以及 1.7% 和 6.5% 之间。四种物质的定量下限均为0.156μmol/L。

关键词：阿昔洛韦、9-羧基甲氧基甲基鸟嘌呤、LC-MS/MS、血清分析、联苯色谱柱

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实验部分（仪器、试剂与材料）

主要仪器设备

LC-MS/MS

试剂材料

甲醇、甲酸、乙酸铵质谱纯；DMSO，盐酸；

9-羧基甲氧基甲基鸟嘌呤-13C2-15N (CMMG-IS)

阿昔洛韦-D4(ACV-IS),GCV-D5(GCV-IS), and PCV-D4(PCV-IS)

96 well-plate 收集板；

样品预处理

将患者样本收集在不含抗凝剂的血清管中，并在 2,000g 下离心 10 分钟，然后将血清转移到新管中，然后进行分析或在 20°C 下储存。

样品净化

将约 150 μL 冷的内标溶液加入到 50 μL 的校准标准品、QC 或血清样品中，短暂涡旋，然后在 10 °C 下以 15,000 g 离心 5 min。取 100 μL 上清液转移至 96 孔板中，用 100 μL 1% 甲酸的 Milli-Q 水溶液稀释，然后混合 10 分钟。

LC-MS/MS色谱条件

色谱柱：Kinetex Biphenyl 色谱柱 (100*2.1 mm, 100 Å, 2.6μm)

预柱： SecurityGuard™Ultra Biphenyl ，2*2.1 mm；

流动相A：10 mmol/L 乙酸铵 pH 6.8；

流动相B：甲醇；

流速：0.5mL/min；

柱温：30 ℃

进样量：2 µL

流动相梯度：见表1

表1.流动相梯度表

时间 (min)	A%	B%
0	98	2
0.3	98	10
2	75	25
2.5	25	75
2.51	95	2
3	98	2

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实验结果

图1 加标 0.156μmol/L 每种物质的校准标准血清提取物

的代表性多反应监测 (MRM) 色谱图

表2 每种物质的特定质谱设置及其相应的内标

表3 所有包含物质的质量控制的准确性和精确度。

在每个质量控制水平（日间测定）和

六个不同天（日内测定）的六次重复单次运行

图3 在 24 小时采样期间从服用单次 200 毫克片剂的

受试者收集的阿昔洛韦 (ACV)

和 9-羧基甲氧基甲基鸟嘌呤 (CMMG) 浓度

结论：

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这项工作描述了一种完全开发和验证的快速定量 ACV、其代谢物 CMMG、GCV 和 PCV 的方法，其优点是预处理时间短，使用少量血清和蛋白质沉淀，使用 1% 甲酸的甲醇溶液（含有相应的作为内标分析的四种物质的同位素标记形式），可实现高提取回收率、最小化测定变异和基质效应。此外，与以前的方法相比，本研究显示了通过使用 LCMS/MS 检测分析物的改进，所有四种分析物的 LLOQ 均为 0.156 μmol/L。使用带有联苯固定相的色谱柱实现了包括选择性和峰形在内的最佳色谱性能，色谱运行时间为 3 分钟。通过选择核-壳联苯固定相来使用替代C18色谱选择性的新颖性表明，即使对于这些相当极性的抗病毒药物，这种固定相也可以作为很好的替代品。

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本文部分摘自：Biomedical Chromatography，Volume36, Issue4，April 2022，e5315