两步解决qPCR结果重复性差，造就完美曲线！

2022-03-01 00:18:26, TIANGEN

在基因功能机制研究中，通过荧光定量PCR技术来验证基因转录水平的变化是基础研究手段之一。而我们经常会遇到荧光定量实验重复性（生物学重复和技术重复）不理想的情况。其中，生物学重复指同一处理下的不同植株、细胞系、动物个体等，技术重复指同一个样本的不同复孔。小编今天跟大家分享这两种重复性差的原因及解决办法。

技术重复性差案例

（理想的技术重复Ct值差值在0.5之内）

生物学重复性差

原因及解决办法

1. 样本处理与取材

A. 取材不严格，基因表达往往是有时空特异性的，同一处理下不同的样本取材部位或取材时间不一致会导致检测结果差异很大。

◆ 同一实验设计的所有样本需取材部位/时间完全一致。

B. 供试材料生长不一或者生物学重复之间处理不一致。

◆ 选取大小均一，生长条件和遗传背景一致的供试材料。

◆ 同一种处理严格按照实验设计，处理剂量一致。

2. RNA质量

A. RNA不同程度降解，导致重复性很差。

◆ 起始样本量尽量一致，不要超过试剂盒规定的范围。

◆ 把控RNA提取的整个流程，防止RNA降解。

B. 提取的RNA有不同程度基因组残留，基因组扩增影响了真实结果。

◆ 跨外显子设计定量引物，使基因组序列不被扩增。

◆ 选用具有去除基因组功能的RNA提取试剂盒。

◆ 选用具有去除基因组功能的反转录试剂，消除基因组的影响。

基因组残留对qPCR结果造成严重影响

1组：不去基因组反转录；2组：不去基因组不反转录；

3组：去基因组后反转录；4组：去基因组不反转录。

C. 提取的RNA有不同程度抑制剂残留，抑制了后续的PCR反应。

◆ 倍比稀释cDNA模板减少PCR抑制剂的影响。

◆ 采用适宜的离心柱法试剂盒提取RNA，以提高RNA纯度。

注：用稳定的内参基因可以校正不同样本之间的差别，但是需要以所有样本都是高质量RNA为前提，对于低质量RNA，内参基因和目的基因可能受影响程度不同而导致不准确定量结果。

3. 反转录

反转录反应体系不同样本模板上样量差异大，造成反转录效率有差异影响了后续结果。

◆ 不同样本的RNA上样量尽量保持相同 (1 μg RNA效果最佳，最多不要超过2 μg)。

4. 样本个体差异

不同的生物个体之间受环境遗传等因素影响会有不同程度的系统误差，对于差异大的个体生物学重复性也会较差。

◆ 尽量选取遗传背景一致的供试实验材料。

◆ 增加生物学重复数量，得到更接近真实值的统计结果。

技术重复性差

原因及解决办法

1. 实验操作问题

A. 没有配制预混体系，各反应孔反应成分不均一，扩增效果不同。

◆ 充分溶解各反应成分，除模板以外的其他成分配制大的预混体系，分装到反应孔，再单独加模板。

B. 没有充分离心，有气泡影响了荧光收集。

◆ 反应体系配制好后要充分离心，除去气泡。

C. 封口膜/管盖没有贴紧导致液体不同程度挥发导致扩增结果不准确。

◆ 封口膜/管盖要与板面/离心管贴紧防止液体挥发造成反应体系损失。

2. 仪器耗材问题

A. 移液器不精准，枪头和离心管等耗材挂壁导致移液误差，反应管/板和封口膜与仪器不配套影响荧光检测。

◆ 定期校准移液器，选用不挂壁和经过实验验证的配套耗材。

B. 有些荧光定量PCR仪器孔与孔之间会产生荧光信号误差造成不同孔Ct值有大的偏差。

◆ 采用校正染料比如ROX，加到反应体系中，分析校正后的荧光信号。

C. 荧光定量PCR仪器光路检测出现问题或者加热模块孔间温度不均一导致边缘效应和扩增误差。

◆ 定期找工程师检查仪器，避开有问题的反应孔。

3. 其他原因

Ct值>30时，Ct值差异比较大，主要由模板浓度低或者基因表达丰度低使反转录效率降低或者DNA聚合酶容易产生非特异扩增造成。

◆ 提高模板浓度从而提高反应效率，增强产物特异性。

◆ 选用灵敏度高的反转录和qPCR试剂，针对低丰度模板能够得到高效特异的扩增。

了解了以上内容，相信下次遇到重复性差的问题，我们就可以根据问题逐一排查了。为了得到重复性高的实验结果，我们除了要有精细的实验设计，良好的实验操作外，也要选择质量过关、性能稳定的试剂来助我们一臂之力。

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