2022-02-28 19:06:23, SCIEX SCIEX
2021年,我国生物制品研制与生产取得多项重要突破。生物大分子药物热度持续增高,重组蛋白药物、血液制品新增上市产品数量是2020年的6倍;细胞和基因治疗药物新增上市2款CAR-T产品,较2020年实现了零突破;全球首款吸入式疫苗研发取得突破。资本市场对生物药领域持续加码,投融资金额较2020年增长1.6倍,显示我国生物药领域拥有巨大创新活力和增长潜力[1].
抗体从头测序在生物制药行业中是非常重要的手段,在发现新的候选抗体药物、鉴定用于研究的试剂以及生物仿制药开发中创新产品的结构确定等方面具有重要应用。目前有多种算法和软件可以根据肽段母离子质量和二级碎片信息进行从头测序,此外,通过搜库的方法也可以获得更完整的信息。但是对于抗体而言,肽段从头测序和搜库策略都具有很大的挑战,因为抗体序列会针对特定抗原进行微调,每个免疫反应都会产生独特的抗体序列,人类中独特抗体序列的数量预计约 100 亿之多[2],这对于从头测序或者蛋白质搜库来说是不可想象的。
目前在抗体从头测序分析中,常用的策略包括谱图的人工注解,迭代搜索及手动序列组装,以及噬菌体展示与质谱的正交结合方法等。但是这些方法非常复杂,时间成本很高,非常不适用于高通量分析需求。我们建立了高效的抗体自动从头测序流程,利用ZenoTOF™ 7600系统产出的碰撞诱导裂解(CID)和电子活化裂解(EAD)数据,使用Protein Metrics软件的De Novo sequencing功能,对曲妥珠单抗进行了完整序列测定,序列覆盖度达到100%,而且在EAD模式下产出的数据,可以对亮氨酸和异亮氨酸进行明确的区分,为抗体从头测序提供了高通量和高可信度的方案。
曲妥珠单抗,作为抗Her 2的单克隆抗体,是第一个用于治疗实体瘤的人源化单克隆抗体,第一个被批准的酪氨酸激酶抑制剂,也是第一个成功以生物标志物为引导的抗癌症药物。它通过将自身附着在Her 2上来阻止人体表皮细胞生长因子在Her 2上的附着,从而阻断癌细胞的生长。
曲妥珠单抗自动从头测序分析的序列覆盖度
曲妥珠单抗样品分别经过Trypsin、GluC、Chymotrypsin、Pepsin和LysC五种酶酶解后得到的肽段样品,在ZenoTOF™ 7600系统中进行CID和EAD数据采集,将数据文件导入Protein Metrics软件中,在De Novo sequencing模块中进行分析。Protein Metrics软件可以对曲妥珠单抗的重链和轻链序列进行正确的解析,序列覆盖度达到100%(图1)。图2展示了轻链 V 区的序列覆盖度,可以看到所有三个互补决定区(CDR)均能很好地被鉴定到。氨基酸序列中绿色序列代表根据二级离子信息得到的高可信度序列,黄色突出显示部分代表中可信度序列。 此外,可变翻译后修饰位点在图中进行了标注,可进一步在软件中查看。
(点击查看大图)
图1. 曲妥珠单抗从头测序轻链和重链序列覆盖度
(点击查看大图)
图2. 曲妥珠单抗轻链可变区序列覆盖度
ZenoTOF™ 7600系统搭载了Zeno TRAP模块,大幅提高离子占空比,有助于提升二级谱图质量。无论在CID模式(图3)还是EAD模式(图4)下,7600系统都可以得到质量很高的二级谱图,BY离子或CZ离子的覆盖度都很高,这对于从头测序的分析来说具有重要意义。
(点击查看大图)
图3. CID模式下肽段二级谱图及序列覆盖
(点击查看大图)
图4. EAD模式下肽段二级谱图及序列覆盖
EAD模式可以很好地区分亮氨酸及异亮氨酸
在ZenoTOF™ 7600系统可以实现EAD碎裂,因此可以对在CID模式下完全无法区分的同分异构体亮氨酸和异亮氨酸进行很好的鉴别,从而得到准确的抗体序列。亮氨酸在EAD模式下可产生z-43的特征性离子,异亮氨酸产生z-29的特征性离子,根据特征性离子的不同可对二者进行区分。图5中展示了在EAD碎裂模式下,含有亮氨酸的序列中产生z-43离子,据此确定序列中氨基酸为亮氨酸,并且此肽段中包含三个亮氨酸,所有亮氨酸均可由二级谱图中的z-29特征离子加以确认。
(点击查看大图)
图5. 包含多各个亮氨酸的片段在EAD模式下的二级谱图
结论
利用ZenoTOF™ 7600系统产出的CID和EAD数据,结合Protein Metrics软件的De Novo sequencing功能,我们建立了高效的抗体从头测序流程,适用于高通量的分析,并且使用EAD数据可以很好地区分亮氨酸和异亮氨酸,从而得到准确可信的序列信息。
【1】2021生物药领域发展回顾,火石创造
【2】Frank, A., Pevzner, P.: PepNovo: de novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Anal. Chem. 77, 964–973 (2005)
声明:版权为 SCIEX 所有。欢迎个人转发分享。其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容须获得授权, 转载时须注明「来源:SCIEX」。申请授权转载请在该文章下“写留言"。
喜欢就点在看哟
02-28 TIANGEN
传感器、成像、发光领域相关文献推荐【学术简讯22年8期】02-28 HORIBA
上新 | 70μL带滤芯自动化吸头:精度升级,适配MGISP-960!02-28 共享未来的
2022年线上首场BLI生物层干涉技术培训02-28
准确PCR结果,少不了电动移液器02-28 赛多利斯
类器官分析指南 | 三个步骤+四大应用,so easy!02-28 陈老湿
为什么选择默克作为您的大包装优选合作伙伴?内有惊喜福利~02-28
喜讯 | 禾信仪器三款核心产品入选《广东省名优高新技术产品名单》02-28
转载 | 直面热点问题,勇于担当作为——浙江省生态环境监测中心全力以赴开展“新污染物”监测02-28
GC配件小帮手——进样口维护套件工具箱来啦!02-28
来自总站的感谢信!致披星戴月的禾信人02-28
视频教学 | LC管线和接头选择02-28
Restek Tips | 液相色谱柱清洗小妙招!02-28
转载 | 全二维气相色谱-飞行时间质谱仪:破译白酒风味组分的秘密武器02-28 ONE
【产品推介】Airstream 系列超净工作台02-28
【邀请函】Esco诚邀您参加第三十五届浙江国际科研、医疗仪器设备技术交流展览会02-28
应用案例 | 以 mRNA 疫苗为例,脂质制剂质控,单个样品仅需 4 分钟!02-28
提名您心中的杰出化学家02-28
会议邀请 | 2022年梅特勒托利多热分析技术交流会-广州站02-28
精雕“稀”刻,包“锂”满意02-28