梯度建模在中控方法开发中的应用

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背景介绍

原料药DBC-501由3个起始原料，经4步反应而得，共含有4个中间体，为考虑杂质传承研究的便利性，考虑将所有中间体和成品的中控方法采用同一个方法进行。

中控方法开发的目的：各步反应中控方法共方法，采集时间较短，同时各中间体考察组分均能基线分离。

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知识空间

化合物结构解析：

成品DBC-501、起始原料、中间体等logD图

由logD图可知，各考察组分中分别含有酸碱性基团，化合物ID9在pH0-5处logD持续变化，化合物ID2、ID4、ID1的logD线平行，pH在0-5处logD持续变化，化合物ID5同时含有酸碱基团，化合物在pH2-5、8.5-14处于单一形态，logD线平稳。综合对比，流动相选择pH5以上或pH8以上较好，考虑到色谱柱耐受性，可选择pH5以上，同时需注意选择具有强缓冲能力的缓冲盐。

实际流动相pH的选择和决策：通过前期实验结果，在不同流动相下DBC-301存在峰形问题（拖尾严重），分析其结构，含有羰基，根据刘国柱博士文章“含活泼羰基化合物RP-HPLC分离的峰变形现象的研究”，碱性流动相会改善活泼羰基化合物的峰形，故从流动相pH进行对比优化。发现对比碱性pH，酸性pH值条件下DBC-301峰形更好，同时色谱柱选择范围更广。故流动相选择酸性pH，同时根据logD线，在pH2-4下，存在5个组分的logD线均平缓，故选择pH2.5的磷酸盐缓冲液。

不同pH条件下DBC-301峰形对比图

（①碱性条件下，pH变大，DBC-301更对称；②酸性条件比碱性条件下DBC-301响应更好）

水相组成的选择和决策：根据肖老师培训内容和相关文献，NaCl可改善化合物峰形，故向酸性流动相中添加NaCl，发现301峰形明显改善，拖尾因子1.067。

不同水相组成下DBC-301峰形对比图

有机相种类的选择和决策：甲醇为氢键供体，乙腈为氢键受体，在HPLC方法开发中会提供不同的选择性，故预实验对比甲醇乙腈的区别。发现考察组分的疏水性相差较大，乙腈洗脱能力更强，在比例变化较小的情况下能达到各组分较好的保留，同时基线更佳。在DBC-301的峰形方面，乙腈明显会改善DBC-301的峰形，故实验设计仅选择乙腈做有机相。

不同有机相下DBC-301峰形对比图

考察溶液选择与决策：在预实验过程中，发现各加标供试品溶液进样，考察组分均能达到基本分离，但中间体2（DBC-102）和成品中存在未知杂质分离较差，故配制含各考察组分（约5μg/l）、DBC-102供试品（约1mg/ml）和DBC-501供试品（约1mg/ml）的混合溶液进样评估方法的适用性。

综上，基于预实验探索，中间体3为含羰基化合物，存在峰形问题；同时各考察组份因结构差异导致疏水性存在较大差异，共方法下需同时考察各组分的分离和合适的保留时间。故在确定流动相pH、水相组成和有机相种类下，通过梯度建模，在较短的采集时间内实现各中间体与其考察杂质的分离。

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梯度因素实验设计和构建数学模型

设计梯度程序单因素实验，共4个实验，设计见下。

采集数据分析

• 不同流动相梯度下，各组分保留顺序不变，保留时间发生变化。

• 更改起始比例，各组分均有不同程度的保留时间变化，k值越小保留时间变化越大。

模型构建

根据上述条件所采集的数据于ACD/AutoChrom上进行建模，并根据建模结果筛选分离度符合要求的条件，建模结果及条件筛选见下。

模型分析：对模型进行分析，发现更改流动相比例，除8、9号峰存在分离问题，其他各组分分离均较好；若需实现8、9号的较好分离，方法采集时间会延长，同时晚出峰的组分峰形变差，灵敏度降低。根据对实验目的和考察组分结构进行分析，8、9号峰为成品的未知杂质，后期可去除，现阶段可合并统计，后续关注工艺去除情况。

经优化后模型

选定条件下各组分间分离度均大于2.5，19个组分峰均在33min前出峰。

模型方法重现确认

由重现图可知，重现图谱与预测图谱基本一致，实现了DBC各步反应中控共方法，同时在保证各考察组分分离的条件下，实现了较短的采集时间。

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总结分析

在HPLC方法开发中，梯度优化是我们最常使用方式，但在多组分分离中，如何快速在最短的时间内实现较佳的分离是个值得思考的问题。根据分析者的经验进行调整充满了不确定性，每个时间点和比例的设置都会影响整体的保留和分离。运用ACD软件辅助方法开发，可利用较少的实验点和数据建模，并自己尝试或让软件给出符合要求的方法，大大减少了在分析方法探索的时间。尤其对于多组分的方法开发具有更大优势。并且分析者也可以在模型中可视化关注不同时间、比例设置分别对各组分的作用机制，便于分析者进行风险评估和把控，使得优化方法具有稳健性。