关于显微镜中激光光斑尺寸的小知识

在显微拉曼光谱仪或荧光显微镜中，激光的光斑尺寸大小是一个重要参数，它取决于激光的波长和显微镜的物镜的特性。

艾里斑

当光穿过任何孔径（例如显微镜物镜）时，就会发生衍射。由均匀照射圆形光圈所产生的衍射图称为艾里斑图（Airy pattern），如图1所示。它由一个明亮的中心圆（称为艾里斑）组成，包含总光强的84％，其余的16％ 分布在一系列逐渐减弱的同心环上。

艾里斑的直径（定义为衍射图样中最小圆斑的直径）通常是显微镜中“光斑大小”的意思。其直径大小取决于激光的波长和物镜的数值孔径（NA）：

艾里斑直径不是光斑尺寸的唯一定义。另外两个常见的定义是衍射图样中光斑在半峰宽（FWHM）或1 / e²峰宽时的大小，由下式：

解决的办法是扩大激光束，使其光束直径大于目标物的后孔径，达到近似均匀的照明，这就是所谓的过度填充。过度填充的程度越大，就越接近均匀照明，光斑的大小也越接近公式1。过度填充是以降低到达样品的激光强度为代价的，并且是在空间分辨率和通过物镜传输的功率间做选择。

激光波长的影响

光斑大小取决于激光波长(公式1)，较短的波长激光器提供较小的光斑和更高的空间分辨率。使用高倍的物镜(100x 0.9 NA)，可以在三种常见的波长下获得光斑大小如图2所示。

图2. 在100x0.9NA物镜下不同波长的光源对应的光斑大小模拟图。

物镜的NA值影响

光斑的大小还取决于物镜的数值孔径(NA)，该数值孔径测量的是光线进入或离开透镜的倾斜度，

其中n是物镜和样品之间介质的折射率，α是进入/出射物镜的光锥的半角。

NA取决于物镜的构造，并且通常随物镜放大倍数的增加而增加。标准空气（n = 1）物镜的NA极限值<1，由于浸油物镜的折射率较高，因此可以将NA提高到约1.4。NA越高，物镜的收光角越大，可以实现的光斑尺寸越小，这在图3中用三个常用的空气物镜进行了说明。

需要注意的是，图3在某种程度上进行了简化，因为模拟假设所有三个物镜的后孔径均被均匀照明。如上所述，这是通过光束扩展和过度填充物镜的后孔来实现的。但是，后孔径的直径随物镜放大倍数而变化，即后孔径的直径随放大倍率的增加而减小。在多物镜系统中，光束扩展通常是针对高放大倍率物镜进行优化的，而具有较大后孔径的低放大倍率物镜(例如，图3中的20X0.4NA)通常不会被过度填充，并且激光的光斑尺寸和衍射图将会有更多的高斯特性。