平台化分析方案，助力探索siRNA疗法新方向

随着越来越多的寡核苷酸获得药品监管机构批准，全球寡核苷酸类治疗药物研究管线及进入临床试验阶段的数量激增，亟需开发出定量和表征该类化合物适用的分析方法。

今天，小编将和大家分享沃特世应用科学家团队基于全新BioAccord LC-MS系统平台开发的两种siRNA偶联物分子表征方法，均能鉴定产品和其他潜在杂质的相关信息，能为抗体siRNA偶联药物研发与质量控制的方法开发提供参考借鉴。还将分享基于高性能表面(HPS)技术设计带来的siRNA分离科学上的突破性优势，令传统分析常会遭遇的四大“顽疾问题”迎刃而解。

图1. 抗体siRNA偶联物

siRNA偶联物

表征方法

siRNA偶联物的生产有多种合成路线，通常涉及在siRNA 3’端增加连接子以便与mAb分子上的官能团发生偶联反应。如图1所示，对载体mAb的Fc糖基化修饰位点进行工程化处理，增加半胱氨酸残基以便进行偶联反应。药物载荷siRNA包含正义链和反义链，正义链的5’端带有荧光染料，而3’端则带有增加的胺基，可通过连接子与载体mAb的Fc结构域上半胱氨酸残基的巯基进行偶联反应。 

图2. 搭载AQUITY Premier的BioAccord LC-MS平台，具有专为不同应用定制的工作流程，可大幅提升生物制药分析速度。

利用负离子模式下执行的反相离子对(IPRP LC-MS)对siRNA（正义链和反义链）的精确分子量进行分析确定（通过waters_connect中的MaxEnt1解卷积计算，结果见图3），实测分子量和理论分子量高度吻合。 

图3. 正义链和反义链的完整分子量（MaxEnt1解卷积结果）。

siRNA偶联物表征的重点目标是鉴定DAR1和DAR2，但仅凭传统的色谱方法和光学检测器(UV或FLR)无法确认这些物质的鉴定结果，而LC-MS分析方法可直接确认质量数，⾮常适用于DAR测定。载体mAb的RPLC-MS分析最初用于检查mAb分子的完整性（在将Fc区的天冬酰胺(N)残基替换为半胱氨酸(C)残基之后）。解卷积谱图（图4上）的主峰表明mAb实测分子量与其理论分子量值匹配。非变性SEC-MS实验旨在判断样品中是否存在DAR1和DAR2，而非变性流动相则有助于双链siRNA在ESI+ MS处理期间保持完整性，并在MaxEn1解卷积谱图中观察到DAR1和DAR2，此外，还观察到没有反义链的DAR1和DAR2（图4下）。

图4. 载体蛋⽩的电荷解卷积完整分子量。实测载体蛋⽩的质量精度为10 ppm（上图）；⾮变性SEC-MS分析检出的电荷解卷积DAR。观察到代表DAR1和DAR2的峰。此外，还检出了主要副产物单链（正义链）DAR（下图）。

以上分享了沃特世科学家团队开发的两种LC-MS方法用于确认siRNA（正义链和反义链）的鉴定结果以及抗体-siRNA分子在样品中的分布（采用非变性SEC-MS条件），采用了超高效液相色谱系统联合高分辨率质谱检测器以开发优化方法和工作流程。且其易于操作，⽆需对BioAccord系统做过多优化即可获得高质量的数据，其稳定可靠的优势一目了然。此外其运行环境为符合法规要求的信息学系统waters_connnect，支持从研发实验室到QC实验室方法的快速转移。

四大典型难题及解决方案

众所周知，⼀款获批的寡核苷酸类治疗药物从早期开发阶段到后续质量控制流程全程都需要使用有效的表征方法，而且这些分析方法必须⾜够稳定可靠且简便，以便在不同环境中执行。siRNA通常在变性液相色谱条件下分析，两个寡核苷酸经过变性可产生两个单独的化合物（称为单链）以供分析。siRNA也可以在非变性条件下作为完整双链体以供分析，以验证双链体未被不需要的过量单链寡核苷酸物质污染。然而，无论是在变性条件还是在非变性条件下分析工作者总会遇到以下四大典型难题：

由于酸性寡核苷酸是通过离子相互作用吸附到色谱柱金属表⾯，因此会导致样品回收不完全；且重复进样会使可用的离子吸附位点达到饱和，因此使得样品回收率得以提升，即 “样品老化”。此外，虽然常规不锈钢色谱柱可通过重复进样或其他方案进行老化，但酸性样品在金属色谱柱表面的离子吸附则增大了方法开发和样品定量的难度。

图5. 使⽤ACQUITY UPLC BEH C18, 300 Å肽分析专⽤柱连续五次进样3 μL双链体C (0.40 mg/mL)得到的结果 (上）；改⽤ACQUITY Premier BEH C18, 300 Å肽分析专⽤柱（其⾦属硬件经过杂化硅胶层改性处理），消除了寡核苷酸在⾊谱柱硬件上的不良吸附（下）。

在后续研究中评价了两种siRNA分子的混合物（以双链体A+双链体B作为测试分析物）的定量线性。在低标示浓度下，常规色谱柱表现出样品损失。虽然采用两种色谱柱所得到的校准曲线线性拟合结果都具有可接受的相关系数（分别为0.9977和0.9995），但常规不锈钢⾊谱柱在标示浓度为0.2%和1.0%时的信号等于0。由于其具有非特异性吸附的性质，使得低浓度下的样品损失更明显，从而导致校准的动态范围缩小。换言之，采用常规色谱柱时，无法可靠定量分析低标示浓度的寡核苷酸。观察到ACQUITY Premier色谱柱的线性损失很小，其少量样品损失与常规UPLC系统中存在的⾦属吸附位点有关（进样针、管路和检测池）。

图6. 在双链体A+B样品的线性研究中得到的校准曲线及进样不同标⽰浓度的样品所得到的回收率值。

⼀般来说，与单链寡核苷酸相比，双链体DNA或RNA在IP-RP LC中的保留性更强。单链物质在色谱图早期洗脱，并与双链体完全分离。但是，由于制剂中存在两种单独的siRNA双链体，使得分离任务也变得更复杂。分离双链体1与双链体2是⼀项公认的挑战。在所有被测色谱柱中，填充1.7 μm吸附剂的150× 2.1 mm ACQUITY Premier BEH C18, 300 Å肽分析专用柱提供了出色的分离结果。请注意，双链体1和2均被分离成多个峰。siRNA双链体洗脱区域内的所有峰都具有其预期质量数。显然，这种分离是由于双链体物质中存在光学异构体（非对映体）导致的。 单链寡核苷酸母体含有可产⽣光学异构体的核苷酸间硫代磷酸酯键。且由于存在非对映体，单链物质的“峰展宽”也很明显，其中双链体2的反义峰较为显著。

样品在金属液相色谱系统硬件和标准不锈钢色谱柱上的吸附疑似是造成核酸液相色谱分析中样品残留升高的影响因素之一。 我们使用优化方法评价了ACQUITY Premier BEH C18, 300 Å肽分析专用柱的样品残留性能。如图9显示，空白样色谱图不包含任何显著的系统峰；且观察到因梯度程序导致的适度基线漂移。接下来进样0.2%定量限标准品（LOQ样品水平）用于比较，其可接受的残留应明显低于LOQ样品信号。随后进样100%样品标准品（数据未显示）；主要siRNA信号响应分别为1.2 AU和0.6 AU，然后再执行⼀次空白进样。图谱显示，残留低于噪音水平，且该结果可确证其残留不会影响定量结果。

图9. IP-RP LC残留研究。

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