2021-10-29 09:23:10, TIANGEN
荧光定量实验中,绝对定量主要利用标准曲线和样品的Ct均值来推算样品的真实拷贝数,而相对定量主要利用目的基因和内参基因的相对标准曲线,来帮助判断样品的模板稀释倍数和引物的扩增效率。小编今天就带大家制作出高质量的标准曲线。
绝对定量分析中标准曲线制作方法
标准品的制备
标准品可以是包含目的片段的PCR产物,可以是包含目的片段的质粒,或体外转录的RNA。标准品提供一个浓度标准,如果产生降解,也就不能被用做标准了。质粒是最稳定也是最常用的标准品。
01
质粒标准品制作流程
Step1. 以DNA/cDNA为模板,利用定量引物扩增目的片段。
Step2. 目的片段连接到线性化质粒载体上。
Step3. 阳性斑筛选,测序鉴定后,完成质粒标准品构建。
Step4. 利用紫外分光光度计测定质粒浓度,根据质粒大小即可换算出其浓度或者拷贝数。
Step5. 原浓度标准品以10为倍数按照下图方式进行倍比稀释,得到6个不同浓度的标准品。
02
标准品模板拷贝数计算方法
以双链DNA为例:
1 OD260 = 50 ng/μl 双链DNA
待测样本浓度(ng/μl) = OD260×50 (×稀释倍数)
脱氧核苷酸平均分子量=324.5
1 μl双链DNA标准品物质的量(mol) = (稀释倍数×OD数×50×10-9)/(序列长度×649)
1 μl双链DNA标准品的数量(copies) = (稀释倍数×OD数×3×1016)/(序列长度×649)
标准曲线的制作
以不同浓度的标准品为模板,每一个标准品至少3个技术重复,同时做qPCR扩增,如果在荧光定量仪器上提前设置好标准品的不同浓度,那么反应结束后,仪器会自动生成标准曲线,当然我们也可以用EXCEL软件来生成标准曲线。
上图是我们得到的一个标准曲线的案例,横坐标是模板浓度的lg值,纵坐标是Ct值,公式y=-3.2825x+31.906代表两个变量之间的线性关系,也就是所测反应体系及引物的标准曲线。我们主要通过以下三个要素来评判标准曲线的质量高低。
1. R2:称为决定系数,要求大于0.98,值越高,代表标准曲线的线性化程度越好。
2. 扩增效率En: 要求扩增效率在90%-110%范围内,后续定量结果才更准确,扩增效率En=10-1/斜率 - 1,由公式推算出满足条件的斜率范围是-3.58至-3.1之间。
3. 线性范围:指的是Ct值和模板浓度的lg值之间呈线性关系时模板浓度范围,过低的模板浓度(试剂灵敏度不高)或者过高的模板浓度(含有抑制剂影响)可能不呈线性关系,如果样本浓度超过线性范围,定量不准确。因此,线性范围越宽广,能够准确测量样本浓度的范围也越宽广。
标准曲线常见问题及解决办法
01
相对定量实验中的标准曲线如何制作?
在相对定量实验中无需采用已知浓度标准品制作标准曲线,但需要利用cDNA进行倍比稀释(2-5倍),同时对目的基因和内参基因进行定量扩增,从而分别制作它们的相对标准曲线。
02
R2<0.98?
① 不同浓度的标准品之间准确稀释,选择低核酸吸附的耗材移液和保存标准品。
② 小心操作,增加技术重复,配制预混mix,以提高数据的重复性。
③ 选择稳定的定量试剂进行扩增。
03
线性范围不宽广?
① 标准品浓度范围应覆盖待测样本浓度范围。
② 采用高效的定量试剂,得到更宽广的定量范围。
04
其他需要注意的问题?
① 标准品与待测样品应在同一体系及程序下测定,设置相同的荧光阈值。
② 制备的标准品需要分装,避免反复冻融产生降解,一旦某个标准品Ct值与之前的值相差0.5以上,则需要重新制作标准品。
在核酸检测实验中,如果用H2O稀释核酸模板,可能无法缓解某些耗材管壁对核酸吸附的影响,另外核酸经过反复冻融后特别容易降解,这些都会带来后续定量不准确的问题。针对这些问题,TIANGEN特别开发了一款核酸标准品稀释液,可以减少耗材管壁对核酸的吸附,并且大力缓解核酸经过反复冻融后造成的降解,梯度稀释后的核酸标准品线性程度比H2O效果更好。
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