【干货】手把手教你快速做出高质量的标准曲线

绝对定量分析中标准曲线制作方法

标准品可以是包含目的片段的PCR产物，可以是包含目的片段的质粒，或体外转录的RNA。标准品提供一个浓度标准，如果产生降解，也就不能被用做标准了。质粒是最稳定也是最常用的标准品。

Step1. 以DNA/cDNA为模板，利用定量引物扩增目的片段。

Step2. 目的片段连接到线性化质粒载体上。

Step3. 阳性斑筛选，测序鉴定后，完成质粒标准品构建。

Step4. 利用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据质粒大小即可换算出其浓度或者拷贝数。

Step5. 原浓度标准品以10为倍数按照下图方式进行倍比稀释，得到6个不同浓度的标准品。

以双链DNA为例：

1 OD₂₆₀ = 50 ng/μl 双链DNA

待测样本浓度(ng/μl) = OD₂₆₀×50 (×稀释倍数)

脱氧核苷酸平均分子量=324.5

1 μl双链DNA标准品物质的量(mol) = (稀释倍数×OD数×50×10^-9)/(序列长度×649)

1 μl双链DNA标准品的数量(copies) = (稀释倍数×OD数×3×10¹⁶)/(序列长度×649)

以不同浓度的标准品为模板，每一个标准品至少3个技术重复，同时做qPCR扩增，如果在荧光定量仪器上提前设置好标准品的不同浓度，那么反应结束后，仪器会自动生成标准曲线，当然我们也可以用EXCEL软件来生成标准曲线。

上图是我们得到的一个标准曲线的案例，横坐标是模板浓度的lg值，纵坐标是Ct值，公式y=-3.2825x+31.906代表两个变量之间的线性关系，也就是所测反应体系及引物的标准曲线。我们主要通过以下三个要素来评判标准曲线的质量高低。

1. R²：称为决定系数，要求大于0.98，值越高，代表标准曲线的线性化程度越好。

2. 扩增效率En: 要求扩增效率在90%-110%范围内，后续定量结果才更准确，扩增效率En=10^-1/斜率  - 1，由公式推算出满足条件的斜率范围是-3.58至-3.1之间。

3. 线性范围：指的是Ct值和模板浓度的lg值之间呈线性关系时模板浓度范围，过低的模板浓度（试剂灵敏度不高）或者过高的模板浓度（含有抑制剂影响）可能不呈线性关系，如果样本浓度超过线性范围，定量不准确。因此，线性范围越宽广，能够准确测量样本浓度的范围也越宽广。

标准曲线常见问题及解决办法

在相对定量实验中无需采用已知浓度标准品制作标准曲线，但需要利用cDNA进行倍比稀释（2-5倍），同时对目的基因和内参基因进行定量扩增，从而分别制作它们的相对标准曲线。

① 不同浓度的标准品之间准确稀释，选择低核酸吸附的耗材移液和保存标准品。

② 小心操作，增加技术重复，配制预混mix，以提高数据的重复性。

③ 选择稳定的定量试剂进行扩增。

① 标准品浓度范围应覆盖待测样本浓度范围。

② 采用高效的定量试剂，得到更宽广的定量范围。

① 标准品与待测样品应在同一体系及程序下测定，设置相同的荧光阈值。

② 制备的标准品需要分装，避免反复冻融产生降解，一旦某个标准品Ct值与之前的值相差0.5以上，则需要重新制作标准品。

1. 抑制耗材管壁对核酸的吸附性。

2. 缓解反复冻融对核酸产生的降解影响。

3. 可用于DNA核酸标准品稀释，cDNA稀释和NGS文库稀释。

采用TIANGEN核酸标准品稀释液（RT504）和H₂O、某品牌同类产品，倍比稀释不同的模板后进行qPCR检测，RT504效果优异。经过三种试剂稀释后的模板反复冻融20次，RT504依旧能够保持良好的扩增效率和线性化关系，性能优异。

图一. RT504稀释文库标准品（100 pM - 0.01 pM共5个梯度），反复冻融20次，模板保持良好。

图二 RT504稀释293T细胞cDNA（10 ng/μl - 0.001 ng/μl共5个梯度），反复冻融20次，模板保持良好。